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非水介质中β-葡萄糖苷酶催化合成糖苷类活性物质的研究

作　者: 郭春侠
导　师: 王梦亮
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: β-葡菊糖苷酶非水介质离子液体红景天甙酪醇氢醌
分类号: TQ464.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

糖苷具有广泛的生理和药理活性,但在天然产物中含量低满足不了需求,主要通过愈伤组织悬浮培养法和化学合成法获得。由于愈伤组织培养法周期长,化学合成法经多步保护去保护的过程,且产物纯度不高,酶催化合成糖苷具有明显的优势：反应条件温和、产物纯度高,避免化学合成法繁琐的保护和去保护步骤；同时,糖苷受体廉价易得,成本低。因此,生物催化合成糖苷成为研究热点。糖苷酶具有催化糖苷键水解和糖基转移双重活性,可用于合成寡糖、烷基糖苷和芳香基糖苷,以及对氨基酸、多肽、抗生素等进行糖基化修饰。在水相中由于产物糖苷易水解,大大降低了催化合成的效果,相对于水相而言,非水介质用于酶促合成糖苷反应具有明显的优势,通过有效抑制产物的水解反应从而提高收率。本文分别在有机溶剂和离子液体中构建β-葡萄糖苷酶催化糖苷合成反应体系,并优化其催化条件,以期提高红景天甙的产量和收率,为研究酶催化机制和糖苷类活性物质的工业化合成提供理论依据。其主要内容如下：1.通过对固态发酵产酶培养基组分及培养条件进行优化,提高产酶能力。确定了最佳产酶培养基：麸皮8 g,玉米芯2 g,蛋白胨0.3%,水杨苷0.05%,水10mL自然pH。将发酵浸提液经硫酸铵分级沉淀、透析、冷冻干燥获β-葡萄糖苷酶粗酶,该酶的比活从59.94 U/mg提高到164.57 U/mg,纯化倍数为2.75。2.构建了有机溶剂/缓冲液反应体系,并对反应条件进行优化,采用高效液相色谱法为检测手段,考察了聚乙二醇(PEG)修饰的β-葡萄糖苷酶的催化性能。结果表明,PEG-β-葡萄糖苷酶复合物比游离酶对有机溶剂的耐受性增强,催化活性更高,其催化合成的最佳条件为：在正己烷反应体系中,底物浓度酪醇30 mol/L,D-葡萄糖与酪醇摩尔比为1：1,于50℃反应50 h,红景天甙收率最高可达59.2%。为验证该反应体系的适用范围,进行了氢醌的糖苷合成反应。3.构建了离子液体反应体系,离子液体[bmim]PF6对糖苷酶具有良好的生物相容性,同有机溶剂相比,可提高糖苷酶的催化能力,增加底物溶解度,在优化条件(pH5.8,50℃,含水量2%,24h)下,红景天甙产率高达88.5%。离子液体的使用有利于产物分离和酶的重复利用,在该反应体系中酶可重复利用6次,其催化性能下降缓慢。

全文目录

中文摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
第一章绪论  13-24
  1.1 生物催化合成糖苷  13-16
    1.1.1 糖苷化合物的意义及合成方法  13-14
    1.1.2 生物催化合成糖苷及其催化机制  14-15
    1.1.3 糖苷酶非水相催化合成糖苷物质  15-16
  1.2 离子液体中酶催化研究进展  16-21
    1.2.1 离子液体的种类及性质  17
    1.2.2 离子液体中酶催化反应类型  17-18
    1.2.3 离子液体用于生物催化的优势(同有机溶剂相比)  18-19
    1.2.4 影响离子液体中酶催化反应的因素  19-21
  1.3 红景天甙研究进展  21-22
  1.4 本课题的研究目的与主要内容  22-24
第二章米曲霉β-葡萄糖苷酶的固态发酵培养及性质研究  24-31
  2.1 材料与方法  24-25
    2.1.1 实验材料  24
    2.1.2 主要仪器  24
    2.1.3 实验方法  24-25
  2.2 结果与分析  25-30
    2.2.1 葡萄糖标准曲线的制定  25-26
    2.2.2 培养基的优化  26-28
    2.2.3 培养条件的优化  28-29
    2.2.4 酶学性质的研究  29-30
  2.3 结论  30-31
第三章非水相介质中β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究  31-38
  3.1 材料与方法  31-33
    3.1.1 实验材料  31
    3.1.2 主要仪器  31
    3.1.3 实验方法  31-33
  3.2 结果与讨论  33-37
    3.2.1 酶活力测定结果  33
    3.2.2 红景天甙标准曲线的制定  33
    3.2.3 反应介质的选择  33-34
    3.2.4 催化条件的优化  34-36
    3.2.5 产物的分析  36-37
  3.3 小结  37-38
第四章非水介质中β-葡萄糖苷酶催化氢醌的研究  38-42
  4.1 材料与方法  38-39
    4.1.1 实验材料  38
    4.1.2 主要仪器  38
    4.1.3 实验方法  38-39
  4.2 结果与讨论  39-41
    4.2.1 产物的分析  39-40
    4.2.2 反应条件的优化  40-41
  4.3 小结  41-42
第五章离子液体中β-葡萄糖苷酶生物催化合成红景天甙  42-49
  5.1 材料与方法  42-43
    5.1.1 实验材料  42
    5.1.2 主要仪器  42-43
    5.1.3 实验方法  43
  5.2 结果与讨论  43-48
    5.2.1 反应介质的选择  43-44
    5.2.2 红景天甙合成反应的条件优化  44-48
  5.3 小结  48-49
第六章结论与展望  49-51
  6.1 主要结论  49-50
  6.2 展望  50-51
参考文献  51-57
攻读学位期间取得的研究成果  57-58
致谢  58-59
个人简况及联系方式  59-61

非水介质中β-葡萄糖苷酶催化合成糖苷类活性物质的研究

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