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糯玉米SSAP方法的建立及评价

作　者: 马小锋
导　师: 胡景江
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物学
关键词: 糯玉米分子标记 SSAP 反转录转座子指纹图谱
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

糯玉米起源于我国,是玉米属玉米种的一个亚种。糯玉米经数百年的变异,在株高、粒色、产量、抗性、品质等方面都形成了较大差异,是我国宝贵的玉米种质资源。糯玉米具有甜、粘、香的特点,风味优于普通玉米,其可溶性糖高于普通玉米而低于甜玉米,更适合当前发达国家人们的口味要求。用糯玉米作为原料加工的产品,一定会以独特的风味丰富人们的食谱。因此,深入研究糯玉米的遗传多样性,对糯玉米的新品种选育具有重要的现实和理论价值。本研究主要以1997年由R.Waugh等创立的特异序列扩增多态性(sequence-specific amplification polymorphisms,SSAP)为依据,在糯玉米上建立了此方法,为糯玉米种质资源及遗传多样性研究奠定基础。主要结果如下:1、在综合现有DNA提取方法和试验材料本身性质的基础上,对糯玉米基因组DNA提取进行了了改进:采用高盐的2% CTAB裂解细胞;2%的可溶性PVP以及2%β-巯基乙醇除去酚;先用苯酚:氯仿:异戊醇抽提一次,再用氯仿:异戊醇抽提一次除去蛋白质等杂质;最后用RNase消化,去除RNA,得到纯的DNA。此法提取的DNA其A260/ A280的值介于1.8和2.0之间,A260/ A230的比值大于2.0,且能被MseⅠ酶解完全,符合后续试验对DNA纯度的要求。此DNA提取方法快速、高效、经济,提取的DNA质量好,特别对样品数量多、工作量大和时间紧迫的情况下尤为适用。2、通过单酶切(Mse I)和双酶切(EcoR I、Mse I)对比实验,说明了单酶切不适合于糯玉米SSAP分析;在双酶切试验中发现用EcoR I的引物进行特异性扩增所得图谱清晰、条带质量好、多态性高;同时证明现在人们多采用的高频剪切酶的引物不适合于糯玉米SSAP分析,这与前人普遍采用的高频剪切酶引物做SSAP分析不同。3、初步建立了糯玉米的SSAP分析方法为:(1)酶切:EcoRI、MseI双酶切。先用EcoRI在37℃下酶切3h(Buffer:3μl,EcoRI:0.5μl,DNA:500ng,ddH2O补至15μl)。再加入MseI在65℃下酶切1h(Buffer:1μl,MseI:0.2μl,ddH2O:3.8μl)。取10μl用于下步。(2)连接:用EcoRⅠ和MseⅠ的接头进行连接,22℃下连接2h(Buffer:2.0μl,Ead:0.5μl,Mad:0.5μl,T4 DNA连接酶:0.15μl,ddH2O补至10μl)。(3)预扩:反应体系:10XBuffer:2.5μl,连接后DNA:2.4μl,dNTPs(2.5mM):1.6μl,EcoRI引物(25ng/μl):4.0μl,MseⅠ引物(25ng/μl):4.0μl,Taq DNA聚合酶:1U,ddH2O:补至25μl。反应条件:94℃:5min,94℃:30s,56℃:1min,72℃:1min,30个循环,最后72℃:5min。预扩产物用TE稀释4倍后,完成下面的步骤。(4)选择性扩增:反应体系:10XBuffer:1.0μl,dNTPs(2.5mM):0.8μl,预扩后DNA:0.75μl,EcoRI引物(25ng/μl):0.6μl,特异性引物(25ng/μl):1.2μl,Taq DNA聚合酶:0.5U,ddH2O:补至10μl。反应条件:94℃:5min,94℃:30s,65℃:30s(此步采用touchdown,每个循环降0.7℃),72℃1min,此程序进行13个循环,然后在94℃:30s,56℃:30s,72℃:1min下进行26个循环,最后72℃延伸7min。4、SSAP技术是基于反转录转座子的一种新的分子标记技术。在扩增时需要一个在反转录转座子上的特异性引物,所以知道反转录转座子的序列或者其上的保守序列是必须的。我们的试验发现不同的反转录转座子和相同的限制性内切酶的引物相组合得到条带的数目和多态性有着明显的差别,这就要求必须要有足够多的特异性引物来选择。同时由于不同特异性引物的GC含量不同,所以对于不同的特异性引物需要探究它们合适的退火温度。SSAP技术似乎在重复性方面不如AFLP,但其多的条带数目和高的多态性及相对少的多的引物组合,能节约很多时间,因此该方法是可以肯定,同时继续对其进行更加深入研究也是很有必要的。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-29
  1.1 糯玉米的分布  11-12
  1.2 糯玉米的用途  12-13
  1.3 糯玉米种质资源的遗传多样性  13-21
    1.3.1 形态标记揭示糯玉米种质资源的遗传多样性  13-14
    1.3.2 同工酶等生化标记揭示糯玉米种质资源的遗传多样性  14-16
    1.3.3 细胞学标记  16
    1.3.4 分子标记揭示糯玉米种质资源的遗传多样性  16-21
  1.4 糯玉米种质资源重要农艺性状的配合力和杂种优势  21
  1.5 糯玉米杂交种的选育  21-22
  1.6 糯玉米的起源进化  22-23
    1.6.1 糯玉米的起源地  22
    1.6.2 糯玉米的起源演化途径  22-23
  1.7 叶绿体DNA(cpDNA)及其在植物系统学研究中的应用  23-29
    1.7.1 叶绿体基因组结构变异特点和植物的系统进化  24-25
    1.7.2 应用cpDNA 来研究植物系统发生关系的方法  25-26
    1.7.3 分子系统进化研究对基因的结构与功能研究的意义  26-29
第二章模板DNA 的制备及检测  29-37
  2.1 模板DNA 的制备  29-31
    2.1.1 试验材料、仪器、试剂及方法  29-30
    2.1.2 DNA 质量的检测方法  30-31
  2.2 结果与分析  31-34
    2.2.1 DNA 的纯度  31-32
    2.2.2 DNA 电泳检测结果  32-33
    2.2.3 样品DNA 的酶切效果  33
    2.2.4 样品DNA 的PCR 预扩增和选择性扩增结果  33-34
  2.3 讨论  34-35
    2.3.1 关于DNA 方法的改进  34
    2.3.2 关于材料嫩度对核酸提取效果的影响  34-35
    2.3.3 关于检测DNA 纯度的方法评价  35
  2.4 本章小结  35-37
第三章糯玉米SSAP 方法的建立及评价  37-56
  3.1 试验材料及方法  37-45
    3.1.1 试验材料  37-38
    3.1.2 仪器设备和试剂  38
    3.1.3 试验方法  38-44
    3.1.4 变性聚丙烯酰胺凝胶的制备  44-45
  3.2 结果与分析  45-53
    3.2.1 DNA 模板纯度分析及定量  45-46
    3.2.2 样品DNA 的酶切  46-53
  3.3 讨论  53-54
    3.3.1 影响聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色技术的因素  53
    3.3.2 影响SSAP 成败的关键因素  53-54
    3.3.3 对试验结果的分析及评价  54
  3.4 结论  54-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
个人简介  63

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