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血管紧张素Ⅱ AT_1受体自身抗体对大鼠心室肌细胞动作电位和心肌变力性的影响
作 者: 王澎
导 师: 刘慧荣;刘忠保
学 校: 山西医科大学
专 业: 生理学
关键词: AT1受体自身抗体 大鼠 心肌 全细胞膜片钳
分类号: R392
类 型: 硕士论文
年 份: 2007年
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内容摘要
背景和目的现有资料表明血管紧张素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)具有增强心肌收缩性能、促使心肌肥大和引发心律失常等作用,这些作用都是以心肌细胞的电生理变化作为基础的。Ang-Ⅱ的生物效应主要是通过AT1受体介导的。近几年发现在先兆性子痫和恶性高血压患者血清中存在有Ang-Ⅱ受体-Ⅰ亚型(AT1受体)的自身抗体(AT1-Receptor autoantibody,AT1-R AA),并发现它们对该受体具有激动剂样的生物效应,提示该受体自身抗体可能与这些疾病的发病有关。鉴于AT1受体在心脏的病理变化中具有重要的调节作用,有必要进一步查明AT1-R AA与心脏疾病的关系。为阐明AT1-R AA在心脏疾患发病中的作用,首先需了解该抗体是否对心脏活动有直接效应。本实验室前期研究曾观察到AT1-R AA可增强大鼠心室肌细胞正向和反向钠—钙交换电流,减弱瞬时外向钾电流和内向整流钾电流,并能够使心肌细胞内胞浆钙离子浓度升高,提示AT1-R AA可能具有对心肌的正性变力效应。但是目前尚未见有关于AT1-R AA对心肌最基本的电生理特性——心肌细胞动作电位的影响以及对心肌变力性影响的报道,故本实验着重观察了AT1-R AA对大鼠心室肌细胞动作电位和相关离子电流,以及心肌变力性的影响。材料和方法1、AT1受体自身抗体的制备1.1 AT1受体抗原肽段的合成:按照人AT1受体细胞外第二环的功能表位肽段(165-191位,氨基酸序列为I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T-L)由西安美联生物科技有限公司合成。1.2抗体制备:使用上述抗原肽段对Wistar大鼠进行为期8周的主动免疫,制备抗AT1受体抗血清,其效价用SA-ELISA方法检测。然后利用MAb Trap Kit试剂盒对抗血清中的抗体IgG进行提取和纯化。纯化后的抗体蛋白液混合后,先经PAGE胶凝胶电泳检测其纯度,然后使用考马斯亮兰试剂盒对抗体进行定量。2、心室肌细胞动作电位和离子电流的测定2.1细胞分离:取健康Wistar大鼠,用Langendorff灌流装置经主动脉逆行灌流酶解心脏为单个心肌细胞,选取横纹清晰、膜良好的心肌细胞进行实验。2.2全细胞膜片钳记录方法:细胞复钙,于倒置显微镜下观察,细胞充分贴壁后用台氏液灌流。两步拉制玻璃电极,充灌电极内液,与细胞封接后破膜,记录心室肌细胞动作电位和L-型钙离子通道电流(ICa-L)。2.3分组:(1)正常对照组(control,n=6),正常台氏液灌流:(2)阴性IgG组(negativeIgG,n=6),给予阴性IgG;(3)AT1受体自身抗体组(AT1-R AA,n=6),给予AT1受体自身抗体IgG;(4)AT1受体自身抗体加AT1受体阻断剂组(AT1-R AA+losartan,n=6),同时给予AT1受体自身抗体和AT1受体阻断剂losartan;(5)血管紧张素-Ⅱ组(Ang-Ⅱ,n=6),给予100 nmol/L的Ang-Ⅱ;(6)血管紧张素-Ⅱ加AT1受体阻断剂组(Ang-Ⅱ+losartan,n=6),同时给予Ang-Ⅱ和losartan。AT1-R AAIgG均分别按照10nmol/L、20nmol/L和50nmol/L三个浓度进行处理,观察大鼠心室肌细胞L型Ca++通道电流(ICa-L)电流密度的变化和动作电位时程的变化,并与100 nmol/L的Ang-Ⅱ的作用进行比较。另外还同时观察了AT1受体选择性拮抗剂losartan对抗体IgG的作用的影响。3、在体大鼠心功能的测定健康雄性成年Wistar大鼠,体重250-280g,随机分为5组:正常对照组(生理盐水),AT1受体自身抗体组(生理盐水+AT1受体自身抗体),AT1受体自身抗体加AT1受体阻断剂组(生理盐水+AT1受体自身抗体+losartan),血管紧张素-Ⅱ组(生理盐水+losartan)和血管紧张素-Ⅱ加AT1受体阻断剂组(生理盐水+Ang-Ⅱ+losartan),每组5只。称重后经腹腔注射氨基甲酸乙酯(20%,1g/kg)麻醉,经右颈总动脉行左心室插管,经股静脉注射药物给予不同处理,由ms2000生物信号记录分析系统记录左心室压力和左心室压力变化率等心功能指标。结果1、利用AT1受体细胞外第二环表位功能肽段主动免疫大鼠的结果:免疫大鼠血清中AT1受体自身抗体滴度的变化从免疫后的第二周开始升高(图1:表1)。第二次加强免疫后的第二周(总第八周),大鼠血清中的抗体滴度,从免疫前的1:25.56±9.22升高到1:1490.00±847.58(P<0.01)。对照组的血清抗体未见明显变化。2、AT1受体自身抗体蛋白定性及定量测定结果:PAGE胶凝胶电泳检测结果显示,纯化后的抗体在电泳时,仅有一条条带出现,分子量为160KDa左右,与IgG标准品相一致,表明纯化结果理想。同时,经考马斯亮兰试剂盒测定蛋白浓度为2.38mg/mL。3、AT1受体自身抗体对大鼠心室肌细胞动作电位时程(APD50和APD90)的影响:给予AT1受体自身抗体后的作用结果显示,该抗体可以使大鼠心室肌细胞动作电位的50%复极化时间(APD50)和90%复极化时间(APD90)均呈剂量依赖性缩短(图3,图5,表2,图5)。经过正常台氏液的灌流,APD50和APD90可以大部分恢复,证明该缩短变化是由AT1受体自身抗体作用产生的(图2)。为验证抗体对AT1受体的效应,对比观察了AT1受体激动剂Ang-Ⅱ的作用。结果显示,Ang-Ⅱ的作用与AT1受体自身抗体的作用是一致的,它也可使动作电位时程(APD50和APD90明显缩短(图4,表3)。AT1受体自身抗体与受体激动剂Ang-Ⅱ的作用均可被,AT1受体选择性拮抗剂losartan所阻断。如图(3,4)所示,给予100nmol/L的Losartan后,可以几乎完全拮抗上述Ang-Ⅱ和AT1受体自身抗体对于动作电位APD50和APD90缩短的作用,证明该抗体是通过AT1受体而产生作用的。4、AT1受体自身抗体对大鼠心室肌细胞ICa-L的影响结果显示,10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L浓度的抗AT1受体自身抗体可以明显增加ICa-L电流,并呈剂量依赖性效应(图7,图9,表4)。例如50nmol/L的AT1受体自身抗体可以使ICa-L电流由给药前4.11±0.58(pA/pF)增加到8.55±0.13(pA/pF)(P<0.01)。经过正常台氏液的灌流,该增加部分可以大部分恢复,证明该增加作用是由AT1受体自身抗体作用产生的,而非膜电流不稳定所致(图6)。100nmol/L的Ang-Ⅱ作用的结果显示,AT1受体激动剂Ang-Ⅱ的作用与AT1受体自身抗体的作用是一致的,它也可以显著增加ICa-L电流(图8,表5)。给予100nmol/L的AT1受体选择性拮抗剂losartan后,可以几乎完全拮抗上述Ang-Ⅱ和AT1受体自身抗体对于该电流的增强作用,证明该抗体也是通过AT1受体而产生作用的(图7,8)。5、AT1受体自身抗体对于抑制钠—钙交换电流(INa/Ca)后的大鼠心室肌细胞动作电位的影响本实验室以前的研究证实AT1受体抗体除可增强ICa-L电流外,还可增强钠—钙交换电流(INa/Ca)。为分析AT1受体抗体缩短心肌细胞动作电位时程的机理,我们还观察了用锂离子取代钠离子进行灌流,抑制钠—钙交换电流(INa/Ca)的情况下,AT1-R AA对动作电位时程的影响。结果表明,在抑制钠—钙交换电流(INa/Ca)后,可见动作电位时程缩短(图10),在此基础上给予AT1受体自身抗体,则未再引起大鼠心肌细胞动作电位APD50和APD90的改变(图11,表6)。在此条件下给予Ang-Ⅱ,其结果也与AT1受体自身抗体的作用一致,未再引起大鼠心肌细胞动作电位APD50和APD90的改变(图12,表7)。6、AT1受体自身抗体对大鼠心功能的影响AT1受体自身抗体可显著升高大鼠LVSP、dp/dtmax和-dp/dtmax。Ang-Ⅱ的作用与AT1受体激动剂Ang-Ⅱ的作用一致(图13,图14,图15)。给予AT1受体选择性拮抗剂losartan后,可以大部分消除上述Ang-Ⅱ和AT1受体自身抗体对于心功能的改变,证明该抗体通过AT1受体发挥作用。结论1.按照人血管紧张素Ⅱ受体-Ⅰ亚型(AT1受体)细胞外第二环功能表位肽段(165~191位)的氨基酸序列合成的肽段作为抗原,主动免疫Wistar大鼠,成功获得了高滴度的AT1受体自身抗体(AT1-R AA),并利用高特异性的亲和柱提取后,得到较为理想的足量的纯化IgG,借以进行抗体对心脏活动的生物学效应研究。2.AT1-R AA能显著缩短心肌细胞动作电位时程(APD50和APD90),其作用与AT1受体激动剂Ang-Ⅱ的效应是一致的,提示该抗体对AT1受体有激动剂样效应。此效应可被AT1受体特异性阻断剂所阻断,说明该抗体作用是通过AT1受体介导实现的。AT1-R AA缩短动作电位时程的机制,可能与其促进钙离子内流(增强心室肌细胞ICa-L),继而促进钾离子外流有关。3.AT1-R AA能增强心室肌细胞ICa-L,提示其可通过促进钙内流,增加肌质网Ca++的释放(钙诱导钙释放“CICR”机制),而产生正性变力效应。4.本实验发现用锂离子抑制钠—钙交换电流(INa/Ca)后,抗体对动作电位时程的影响不再出现,间接说明其缩短动作电位时程的作用与钙内流有关。5.AT1-R AA可使在体大鼠心脏产生心肌正性变力效应。
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全文目录
中文摘要 5-9 英文摘要 9-12 正文 12-53 前言 12-14 材料与方法 14-19 结果 19-22 讨论 22-25 结论 25-26 参考文献 26-31 图表 31-53 综述 53-61 正文 53-58 参考文献 58-61 简历 61-62 致谢 62
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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