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嗜酸性氧化亚铁硫杆菌cox、cup和iro基因在亚铁氧化中的作用比较分析

作　者: 崔爽
导　师: 林建强；林建群
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 生物冶金 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌 Fe2+氧化活性 cox基因 cup基因 iro基因 接合转移
分类号: TF18
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是一种专性自养的极端嗜酸的硫杆菌,它广泛分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中,在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥着重要作用,是目前研究最深入,应用最广泛的浸矿细菌之一。它能在酸性条件下将Fe2+氧化为Fe3+,或者将元素硫或还原性硫化物氧化为硫酸,并依靠这些无机物的氧化过程获得能量。浸矿过程中产生的Fe3+是促使矿石中其他金属浸出的氧化剂,因此该菌的亚铁氧化能力与矿石浸出紧密相连。在实际应用过程中,这类细菌生长缓慢,代时长,细胞得率低,限制了它在生产中的应用效率,也给研究工作带来诸多不便。因此,对其进行遗传改造,提高该菌的亚铁氧化能力势在必行。本论文对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌铁氧化系统电子传递链基因进行了克隆鉴定,并与具有广泛宿主的质粒连接,置于强启动子tac下,重新导入该菌中获得表达,研究并比较了所构建菌株的铁氧化活性,生长状况和浸矿能力的变化,为改造这类菌中提供理论和方法依据。首先将A.ferrooxidans19859中的细胞色素氧化酶基因cox,含铜蛋白基因cup,以及亚铁氧化酶基因iro分别克隆至pUC18质粒上,然后亚克隆至pJRD215或pMSD2上,构建重组质粒pTCOX、pTCUP和pTIRO。通过接合转移将这些质粒转入A.ferrooxidans19859中。然后通过菌落PCR等方法验证,表明成功构建了基因工程菌A.ferrooxidans(pTCOX)、A.ferrooxidans(pTCUP)和A.ferrooxidans(pTIRO)。测定了所构建菌株的质粒稳定性,亚铁消耗速率,氧化还原电位,生长曲线和浸矿效率,并进行了比较。结果表明重组质粒能够稳定地遗传,A.ferrooxidans(pTCOX)的铁氧化活性得到较大幅度的提高。然后以A.ferrooxidans野生型为对照,以alaS基因为内参,运用荧光定量对A.ferrooxidans(pTCOX)的rus操纵子内基因的表达情况进行了分析。为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌进一步的基因改良工作提供了理论指导。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
第一章 研究背景综述  8-20
  1.1 生物冶金概述  8-9
  1.2 生物浸出机理  9-10
    1.2.1 生物浸出的直接作用  10
    1.2.2 生物浸出的间接作用  10
  1.3 主要浸矿细菌---嗜酸性氧化亚铁硫杆菌  10-11
  1.4 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的铁氧化机制  11
  1.5 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的亚铁氧化系统  11-18
    1.5.1 顺电势电子传递途径  13-18
    1.5.2 逆电势电子传递途径  18
  1.6 研究目的、意义及主要内容  18-20
第二章 可转移表达质粒pTCOX、pTCUP和pTIRO的构建  20-39
  2.1 引言  20
  2.2 材料与方法  20-25
    2.2.1 菌株和质粒  20-21
    2.2.2 培养基和培养条件  21-22
    2.2.3 试剂和仪器  22
    2.2.4 DNA操作技术  22-25
  2.3 实验结果  25-38
    2.3.1. 基因序列分析  25-26
    2.3.2. 质粒pTCOX的构建  26-29
    2.3.3 质粒pTCUP的构建  29-33
    2.3.4 质粒pTIRO的构建  33-38
  2.4 讨论分析  38-39
第三章 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌A.ferrooxidans(pTCOX)、A.ferrooxidans(pTCUP)及A.ferrooxidans(pTIRO)的构建及各菌株Fe~(2+)氧化活性和浸矿能力测定  39-58
  3.1 引言  39
  3.2 材料与方法  39-47
    3.2.1 菌株和质粒  39-41
    3.2.2 培养基与培养条件  41-42
    3.2.3 实验方法  42-47
  3.3 实验结果  47-56
    3.3.1 重组质粒的接合转移  47-48
    3.3.2 大肠杆菌-嗜酸性氧化亚铁硫杆菌接合转移的验证  48-50
    3.3.3 重组质粒在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌胞内稳定性测定  50-51
    3.3.4 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化曲线的测定  51-52
    3.3.5 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌氧化还原电位的测定  52-53
    3.3.6 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌生长曲线的测定  53-54
    3.3.7 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌各菌株的浸矿效率比较  54-56
  3.4 讨论分析  56-58
第四章 荧光定量PCR检测嗜酸性氧化亚铁硫杆菌A.ferrooxidans(pTCOX)rus操纵子内基因表达情况  58-64
  4.1 引言  58-59
  4.2 材料与方法  59-62
    4.2.1 材料  59-60
    4.2.2 实验方法  60-62
  4.3 实验结果  62-63
    4.3.1 RNA提取质量  62-63
    4.3.2 荧光定量PCR结果  63
  4.4 结果讨论  63-64
第五章 全文总结和展望  64-67
参考文献  67-72
致谢  72-73
学位论文评阅及答辩情况表  73

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中图分类: > 工业技术 > 冶金工业 > 冶金技术 > 微生物冶金
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