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OsCesA4过表达和三个木质素合成相关酶基因RNAi的亚麻转基因研究

作　者: 李翔
导　师: 陈信波
学　校: 湖南农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亚麻韧皮纤维木质素纤维素遗传转化体系 4CL
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

亚麻(Linum usitatissimum L.)是自然界三大纤维作物之一。亚麻纤维属于初生韧皮纤维,具有拉力强、柔软、细度好等特点。因为自花授粉,基因组相对较小等优点,亚麻作为研究麻类纤维发育的模式作物。在纺织和造纸业中,木质素含量越高,就越增加脱胶沤麻过程的时间,降低韧皮纤维的质量,增加工业污染。本研究构建了纤维素合成酶OsCesA4基因的过表达载体和亚麻木质素合成相关基因RNA干扰的植物表达载体,并对亚麻遗传转化体系进行了摸索优化,为研究通过基因工程手段提高亚麻纤维素含量和(?)质素含量奠定了基础。研究结果如下：1.本研究通过酶切的方法,从含有OsCesA4的全长cDNA序列AK100475的pFLCI质粒载体上获得3462bp全长cDNA,并将其平末端连接入pCAMBIA1301M表达载体中,构建了植物过表达载体pOsCesA4-OE。经酶切和测序鉴定确认植物过表达载体构建正确。2.通过PCR方法扩增出亚麻木质素合成酶相关基因CCoAOMT、4CL、COMT用于RNAi的顺反式片段。并通过中间载体pB3D-Linker连接最后连入表达载体pCAMBIA1301M中,构建了RNAi植物表达载体pCCoAOMT-RNAi、p4CL-RNAi和pCOMT-RNAi。3.优化了农杆菌介导的亚麻遗传转化体系。实验摸索确定了最佳的预培养时间为10d,浸染时间为30min,共培养时间为3d,筛选分化阶段潮霉素的使用浓度为10mg/L,生根阶段潮霉素的使用浓度为15mg/L。4.获得了4CL基因的RNAi亚麻转基因植株,并通过DNA水平检测为阳性转基因植株。RT-PCR检测结果显示转基因植株中4CL的表达量下调,说明该基因的表达受到抑制。其他表达载体pOsCesA4-OE, pCCoAOMT-RNAi和pCOMT-RNAi转化亚麻已得到一些抗性不定芽,但是由于在后续壮苗和生根过程中出现了一些问题,暂时还没有得到移栽成活的转基因植株。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-12
第一章前言  12-21
  1 亚麻韧皮纤维发育研究进展  12-15
    1.1 韧皮纤维细胞伸长  12-13
    1.2 韧皮纤维细胞次生壁加厚  13-14
    1.3 纤维特异性半乳聚糖和高尔基体在次生细胞壁加厚中的作用  14
    1.4 ESTs和基因芯片分析在亚麻韧皮纤维发育中的研究进展  14-15
  2 植物纤维素合成酶基因研究进展  15-17
    2.1 纤维素合成酶基因的结构特点  16
    2.2 纤维素合成酶基因的功能及表达调控  16-17
    2.3 亚麻纤维素合成酶基因的研究进展  17
  3 木质素合成相关酶基因研究进展  17-19
    3.1 木质素合成途径  18-19
    3.2 木质素合成途径相关酶基因研究  19
    3.3 亚麻木质素合成相关酶基因研究  19
  4 转基因技术在亚麻中的研究进展  19-20
  5 本研究的目的和意义  20-21
第二章 OsCesA4基因过表达载体构建  21-30
  1 材料  21-22
    1.1 质粒载体与菌种  21
    1.2 试剂  21
    1.3 基本培养基  21-22
  2 实验方法  22-27
    2.1 OsCesA4过表达载体构建技术路线  22-23
    2.2 OsCesA4全长cDNA的获得  23-24
    2.3 表达载体酶切  24
    2.4 目的片段与表达载体的连接反应  24
    2.5 大肠杆菌感受态制备及质粒的热激转化  24-25
    2.6 重组子的鉴定  25-26
      2.6.1 菌落PCR  25
      2.6.2 质粒PCR  25-26
      2.6.3 酶切检测  26
      2.6.4 质粒测序检测  26
    2.7 农杆菌质粒转化及保存  26-27
      2.7.1 大肠杆菌质粒的热激转化  26
      2.7.2 农杆菌质粒的冻融法转化  26-27
      2.7.3 农杆菌质粒检测  27
      2.7.4 重组质粒的农杆菌保存  27
  3 结果与分析  27-29
    3.1 OsCesA4全长cDNA酶切片段获得  27-28
    3.2 pOsCesA4-OE重组质粒检测  28
      3.2.1 重组质粒酶切检测  28
      3.2.2 重组质粒测序结果  28
    3.3 表达载体转化农杆菌检测  28-29
  4 讨论  29-30
第三章亚麻木质素合成相关基因RNA干扰载体构建  30-40
  1 材料  30-31
    1.1 质粒载体与菌种  30
    1.2 试剂  30-31
    1.3 基本培养基  31
  2 实验方法  31-34
    2.1 亚麻木质素合成相关基因RNAi载体的构建技术路线  31-32
    2.2 引物设计  32
    2.3 PCR扩增目的片段  32-33
    2.4 顺式片段与中间载体的连接  33
    2.5 反式片段与顺式+3D-Linker的连接  33
    2.6 顺式+3D-linker+反式片段与表达载体的连接  33-34
    2.7 农杆菌重组质粒的转化及保存  34
  3 结果与分析  34-38
    3.1 木质素合成相关基因RNAi顺、反式片段PCR扩增  34-35
    3.2 重组质粒检测  35-38
      3.2.1 顺式片段与中间载体pB3D连接  35-36
      3.2.2 反式片段与中间载体连接  36-37
      3.2.3 顺式片段+3D-linker+反式片段与表达载体的连接  37-38
      3.2.4 重组质粒测序结果  38
    3.3 表达载体转化农杆菌检测  38
  4 讨论  38-40
第四章亚麻遗传转化的研究  40-52
  1 材料  40-41
    1.1 植物材料  40
    1.2 表达载体  40
    1.3 主要试剂  40-41
    1.4 培养基  41
  2 实验方法  41-44
    2.1 亚麻遗传转化条件的优化  42-43
      2.1.1 亚麻无菌苗的获得  42
      2.1.2 潮霉素、头孢霉素、羧苄青霉素敏感性实验  42
      2.1.3 亚麻下胚轴的预培养  42
      2.1.4 农杆菌浸染  42
      2.1.5 农杆菌与亚麻下胚轴的共培养  42
      2.1.6 抗性筛选培养  42
      2.1.7 抗性芽的生根培养  42-43
    2.2 转基因亚麻的检测  43-44
      2.2.1 GUS瞬时检测  43
      2.2.2 DNA水平上检测转基因亚麻  43
      2.2.3 RNA水平上检测转基因亚麻  43-44
  3 结果与分析  44-50
    3.1 潮霉素、头孢霉素、羧苄青霉素对亚麻分化能力的影响  44-45
      3.1.1 潮霉素选择压力的确定  44
      3.1.2 头孢霉素和羧苄青霉素敏感性实验  44-45
    3.2 预培养时间对转化的影响  45-46
    3.3 农杆菌浸染时间对转化的影响  46-47
    3.4 共培养时间对转化的影响  47
    3.5 亚麻遗传转化体系的建立  47
    3.6 转基因亚麻的GUS检测  47-49
    3.7 DNA水平上检测转基因亚麻  49
    3.8 RT-PCR检测转基因亚麻  49-50
  4 讨论  50-52
    4.1 预培养对遗传转化的影响  50
    4.2 浸染、共培养时间对转化的影响  50
    4.3 抗生素对筛选的影响  50-51
    4.4 筛选对亚麻再生的影响  51-52
第五章结论  52-53
参考文献  53-59
附录  59-60
致谢  60-61
作者简介  61

OsCesA4过表达和三个木质素合成相关酶基因RNAi的亚麻转基因研究

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