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苯并（a）芘诱导BEAS-2B细胞恶性转化及其转化过程中基因表达模式的研究

作　者: 颜璐
导　师: 张天宝
学　校: 第二军医大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 永生化人支气管上皮细胞苯并(a)芘恶性转化基因芯片
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率及死亡率增长迅速,世界卫生组织统计,估计有1352132新发病例和1178918人死亡(WHO, 2002)。发达国家发病率高于发展中国家。肺癌发病率近年来在我国增长很快,2002年我国肺癌发病男性为269650人,女性为126718人(WHO, 2002)。肺癌的自然病程中临床症状出现较晚,传统的放疗、化疗及手术治疗并不能降低病死率。因此,“早期发现、早期诊断.早期治疗”.是降低肺癌死亡率的重要措施,而这些都将基于肺癌发病机制的阐明。肺癌机制研究的方法目前主要包括对人群的研究,以及利用动物模型,细胞恶性转化模型进行研究。对于细胞恶性转化模型的研究大致分为三类细胞,成纤维细胞,胚胎肺细胞,以及人支气管上皮细胞,成纤维细胞与胚胎肺细胞,培养简单,成本低,人支气管上皮细胞的培养较困难,且费用很高,但就肺癌的组织学类型而言,除了肺腺癌中的细支气管肺泡癌之外,其余各种类型的肺癌均起源于人支气管上皮细胞。苯并(a)芘是已知的可致肺癌的致癌物,空气、土壤、水及食物中均有它的存在,食品制作与加工中,温度超过180度就会有苯并(a)芘的产生。它由有机物质的高温分解和不完全燃烧形成,也可由人类生产和生活活动产生以及自然生成,日常生活中经常被摄入到人体,是一种广泛存在的环境污染致癌物。近几年来对肺癌组织及恶性转化的细胞进行了大量的研究,筛选了一批基因及蛋白质,也观察了某些利用肺癌组织筛选出的已知基因在转化细胞中的表达情况,但是由于研究对象是癌变后的细胞和组织,并不一定能说明找到的是真正关键的基因,而且肺癌的发生不是由于一个两个基因而是多个基因共同作用的结果。我们认为要真正解决肺癌的早期发现、早期诊断问题,首先需要寻找癌变的关键阶段,然后阐明其变化特征和机制。本研究首先建立了已知致癌物B(a)P诱导人支气管上皮细胞转化的细胞模型,在确定细胞恶性转化的基础上,利用基因芯片分析致癌物作用后至细胞转化过程中不同代次细胞基因组的表达变化模式,为寻找出可能发生癌变的关键阶段、揭示致癌机制提供科学依据。方法:(1)采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B,分设100nmolB(a)P组和DMSO溶剂对照组,染毒时间24h后细胞常规培养,系统观察发生于转化过程中的细胞生物学特性并由血清抗性、锚着独立性生长能力,裸鼠成瘤试验来鉴定细胞的恶性转化情况,建立B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化不同代次的细胞模型。(2)采用细胞遗传学方法分析了不同代次细胞的染色体改变(3)提取BEAS-2B经B(a)P诱导后第1、5、10、20、30代细胞及对照组同代数细胞的mRNA后逆转录标记cDNA探针,与Affymetrix公司U133 plus 2.0人类全基因组表达谱芯片杂交,经Affymetrix扫描仪扫描,GCOS软件读取、处理数据,分析杂交信号强度获得差异表达基因,并对差异表达的基因进行筛选。结果:(1)形态学观察在光镜下观察到,实验组细胞在20代后细胞形态不规则的数量开始增多,核浆比例增大,出现病理性核分裂像。(2)抗性试验第10代时各组细胞血清抗性试验均为阴性,第20代实验组细胞出现血清抗性和倍增时间增长。(3)软琼脂培养25代时实验组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落,细胞数十个左右聚集成团,但生长缓慢,不能进一步形成较大的克隆,达不到每个集落大于50个细胞的标准;至第30代时,实验组细胞即能在软琼脂上形成克隆。软琼脂克隆形成细胞经体外扩增培养后生长紊乱,极性消失,可见重叠生长。(4)动物致瘤性实验目前试验尚未结束,中途死亡实验组裸鼠两只,常规病理切片检查,有异形上皮细胞聚集成团,性质待定。(5)染色体核型分析从第20代出现染色体核型异常,主要类型有多倍体、染色体断裂、双着丝粒等。(6)差异表达基因和基因表达谱分析经人类全基因组芯片检测,得到第1、5、10、20、30代实验组与对照组细胞不同代次细胞表达的基因谱。发现不同代次细胞表达的基因谱有明显不同的特征,且各代之间差异表达的基因也有很大差异,以1、5、30代细胞表达的差异基因为基准对差异基因进行了聚类分析,揭示了这些差异基因在不同代次细胞的表达模式和特征。并对第10代细胞差异表达基因进行了通路分析。结论:(1)建立了B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化的细胞模型,该模型的特点是可对从B(a)P作用后至细胞恶性转化过程中不同代次的同一批细胞进行分析。(2) B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B发生恶性转化的变化特征:第20代血清促分化作用的抗性反应明显增强,25代时可在软琼脂上形成小的细胞集落,但达不到每个集落大于50个细胞的标准,至第30代时,能在软琼脂上形成克隆,软琼脂克隆形成细胞经体外扩增培养后生长紊乱,极性消失,可见重叠生长。从第20代出现染色体核型异常,主要类型有多倍体、染色体断裂、双着丝粒等。(3)经人类全基因组芯片检测,发现第1、5、10、20、30代实验组与对照组细胞不同代次细胞表达的基因谱有明显不同的特征。并观察到不同代次细胞间共同上调或下调的差异基因中,未知基因占很大的比例,提出揭示这些基因的功能对阐明癌变的特征和机制可能是重要的。(4)从已知的与肿瘤相关的基因变化来看,尽管第5代已有肿瘤相关基因的变化,但以10、20代细胞的变化最明显,提示此阶段可能是癌变的关键阶段,而第10代可能是细胞癌变的早期阶段。创新点:分析了细胞恶性转化不同阶段的基因表达谱,筛选了不同阶段的差异表达基因,推测10-20代可能是细胞癌性改变早期的关键阶段。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-14
第一部分苯并(a)芘诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化细胞模型的建立  14-33
  一、实验材料和仪器  14-17
  二、实验方法  17-21
  三、实验结果  21-29
  四、讨论  29-32
  小结  32-33
第二部分苯并(a)芘诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中基因表达谱改变的基因芯片检测  33-69
  一、实验材料与仪器  33-34
  二、实验方法  34-36
  三、实验结果  36-56
  四、讨论  56-68
  第二部分小结  68-69
总结  69-70
参考文献  70-72
致谢  72-73
综述：基因－环境致癌物的交互作用  73-92
参考文献  92-93

苯并（a）芘诱导BEAS-2B细胞恶性转化及其转化过程中基因表达模式的研究

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