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前言青光眼滤过手术失败的主要原因之一是手术后术区成纤维细胞增殖、胶原沉积、滤过泡瘢痕形成,最终使手术建立的房水外引流通道封闭所致。术中和术后局部应用一些抗瘢痕的药物有利于滤过通道长时间开放,提高手术成功率。其中一些已经用于临床,如糖皮质激素和抗代谢药物5氟尿嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素C(MMC),但这些治疗方法并不特异的针对成纤维细胞,不可避免的会带来一些毒副作用,有时甚至引起严重的并发症。寻找高效低毒的药物仍然是目前青光眼研究领域中的热点。随着分子生物学的发展和基因治疗的兴起,转基因治疗方法被引入拮抗瘢痕领域,相对于普通药物而言,转基因治疗靶向性强,副作用小,短期内在组织中可大量表达起效,虽然目前仅处于动物实验阶段,但前途光明。c-ski是细胞内的原癌基因,具有多重生物活性,它对成纤维细胞调节较为复杂,过量表达时对禽类动物胚胎的成纤维细胞增殖起促进作用,却抑制哺乳动物的成纤维细胞增殖。研究表明TGF-beta信号系统是导致瘢痕形成的重要原因,而Smad3和Smad2作为TGF-beta途径重要的信号因子,在瘢痕形成中具有重要作用,c– ski是Smad3和Smad2的辅阻遏因子,双重调控创伤愈合进程,因此,抑制Smad3和Smad2成为了减轻瘢痕形成的新途径。在以前的研究中已经观察到c– ski可以抑制兔耳皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌减轻兔耳增生性瘢痕,但将c– ski用于眼部瘢痕治疗目前国内外均未见有文献报道。值得注意的是青光眼滤过手术不同于一般皮肤创伤,精细手术操作形成的瘢痕体积很小,呈扁平状,周围被缝合的组织包裹而不外露,且所形成的瘢痕周围充斥有不断流动的房水,并不类似外露的皮肤增生性瘢痕。本实验在这方面做一尝试,利用pcDNA3.0裸质粒作为载体,将c– ski导入术区表达调控瘢痕化,重点观察滤过道的组织学变化,同时也对应观察眼压,滤泡形态的改变,精确的了解小梁切除术后瘢痕的动态变化过程和c– ski对这种瘢痕的影响,以期发现新的滤过术后抗瘢痕途径。实验一小梁切除术后滤过道的组织学变化及丝裂霉素对其影响的实验观察目的:观察接受小梁切除术的家兔眼术区瘢痕的形成变化规律,以及瘢痕对眼压和滤过泡形态的影响,在此基础上观察抗代谢药丝裂霉素C(MMC)对术后滤过通道瘢痕作用,为下一步实验的指标和时间点的选择奠定基础并提供对照。方法:对家兔双眼实行小梁切除术,采用自身对照,右眼术中一次性应用浸有0.01M的PBS液的棉片接触瓣下巩膜床,时间4min,左眼同法应用浓度为0.2mg/ml的MMC,随后10ml生理盐水冲洗,术后第1、3、7、14、30、60d时测量眼压(IOP),术后第3、7、14、30、60d分批处死家兔,剜出双眼,术区做病理观察,计算机图像分析胶原量。结果与结论:应用PBS眼滤过术后胶原纤维增殖高峰期在术后3~14d,30d后增殖基本停止,眼压至术后14d恢复正常(P>0.05),术后通常第1d右眼术区滤泡形成,7d后平复,滤过通道在第7d关闭,应用MMC眼术后纤维增殖不明显,眼压在第60d恢复正常眼压(P>0.05),术后通常第3d左眼术区滤泡形成,14d后平复,滤过通道在第60d左右关闭。术后7d内丝裂霉素造成2眼感染, 6眼结膜切口渗漏,5眼角膜水肿混浊。术后眼压与胶原量变化明显相关,术后早期手术失败是瘢痕化造成,而远期失败的原因可能是滤过道塌陷所致,丝裂霉素能长时间的抑制成纤维细胞的增殖和分泌,拮抗术后结膜下和滤过道瘢痕形成,从而在较长时间内控制眼压,但副作用也较明显,应谨慎使用。实验二含LacZ报告基因的pcDNA3.0裸质粒转染小梁切除术后兔眼表达的实验观察目的:观察含LacZ报告基因的裸pcDNA 3.0重组质粒在体转染小梁切除术后家兔眼的表达情况,评价其应用价值,为下一步实验作出鉴定并摸索使用质粒治疗的具体方法。方法:制作家兔双眼小梁切除术后模型,采用自身对照,术后1d在右眼术区局部注射含LacZ报告基因的pcDNA30裸质粒0.1ml(100μg),左眼术区注射等剂量空质粒,通过X-gal染液原位染色检测注射后1、3、6、15d组织标本中报告基因LacZ的表达情况,绘制感染效率曲线。结果与结论:100μg剂量的重组pcDNA 3.0裸质粒可以转染术后滤过区结膜下成纤维细胞并表达携带的基因,表达高峰期主要在3-6d,15d时仍可检测到少量表达细胞,对照侧各个时相点均未检测到表达。证明可以利用局部注射重组的pcDNA 3.0裸质粒的方法携带外源性基因转染家兔小梁切除术后术区组织行基因治疗,并且为使所携带基因长时间持续高水平表达,需每间隔6d注射一次。实验三c-ski质粒抑制小梁切除术后瘢痕形成的研究目的:观察在滤过术后兔眼模型上应用100μg c-ski质粒后滤过道组织病理学变化和其对眼压、滤过泡的作用,评估其应用价值。方法:家兔分两组,双眼实行小梁切除术,一组术中右眼应用0.01M PBS一次性给药作为模型对照眼,左眼同法0.2%MMC处理,另一组右眼术区结膜下自术后起每周注射100μg c-ski质粒至第3周停止,左眼同法注射等剂量空质粒,术后第7、14、21、30、60d时测量眼压,观察滤过泡形态并分批处死家兔,取术区组织,采用组织病理学和免疫组化技术,观察成纤维细胞、新生胶原纤维和炎症细胞的改变。结果与结论:应用空质粒组与模型对照组各时相点的各指标均无差异,相对于模型对照组,MMC在60d内降低眼压作用明显,能长时间抑制成纤维细胞和胶原分泌,c-ski组术后14d才体现出降低眼压的作用,持续至第30d,降幅缓和,并能延长滤过泡寿命,100μg c-ski没有抑制成纤维细胞的作用,但可减低术区胶原纤维增殖。这表明100μg c-ski质粒能抑制滤过术后新生胶原的合成,减轻术后滤过道的瘢痕化,提高手术成功率,虽然作用不及2%丝裂霉素,但临床应用安全性较高。
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