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河豚毒素的快速检测方法研究

作　者: 李德昆
导　师: 林洪
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏工程
关键词: 河豚毒素固定化酶抗血清间接竞争ELlSA 检测
分类号: TS254
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

河豚鱼是指硬骨鱼纲豚形目豚科的各属鱼类，其内脏含有河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX），人畜误食后均能致死。TTX致死剂量为0.5mg／70kg。我国食品卫生部门一直禁止鲜食河豚鱼及其加工制品。 TTX的检测方法主要由日、美两国开发掌握，包括生物法、液相法、荧光检测法、气相及气质联用、电泳法等等。本研究探索并建立了两种快速的检测TTX的方法。第一种方法是利用酶的高度选择性，通过检测TTX的衍生物来检测TTX。即将TTX用碱处理，反应生成C₉碱与草酸盐，通过草酸氧化酶与辣根过氧化物酶来检测草酸盐。草酸盐的生成量与TTX的量成比例关系，从而可以由草酸盐的检测结果推断出TTX的含量。该方法的检测限为2.5μmol／L，线性范围为4.5μmol／L-45μmol／L，批内与批间变异系数；≤10％。此方法为国内外首创的方法。该类方法利用了酶的高度选择能力，可以保证检测的特异性。同时酶法检测时间短，过程易控制，对提取操作要求低，不需要昂贵的仪器设备。该方法可作为一种快速的筛选方法。第二种方法是免疫学方法，即通过制备TTX的单克隆抗体或抗血清，以酶联免疫吸附检测法检测TTX。本研究使用甲醛将TTX与匙孔槭血蓝蛋白交联，通过免疫BaLB／C小鼠与新西兰兔制备TTX抗血清。通过以TTX与牛血清白蛋白的甲醛交联物做包被抗原，建立了间接竞争 ELISA法检测TTX的方法。该方法的检测限为 5ng／kg，线性范围为10ng／kg-300ng／kg，批内与批间变异系数介于10％—20％。本方法利用了抗体的高度特异性，抗干扰能力较强。同时检测耗时短，检测限量低，过程易控制，可作为一种快速定量检测TTX的方法。利用固定化酶法与间接竞争ELISA法检测了河豚鱼肝脏中的TTX的含量，并与小鼠生物试验的检测结果进行了对照。发现该两种方法的检测结果与小鼠生物试验的检测结果相关性良好。对两种方法比较发现酶法适于高含量（≥1mg／kg）TTX的检测，间接竞争ELISA法更适于低含量河豚毒素的快速检测方法研究（三lmg/kg）TTx的检测。两种方法之间具有良好的互补性。这两种快速检测TTX方法的建立，可为在全国范围内进行有毒河豚调查，摸清我国有毒河豚鱼种，加强河豚鱼的卫生管理，预防河豚鱼食物中毒，并在确保消费者健康安全的前提下，有条件的开放鲜河豚鱼市场，促进我国经济的发展作出贡献。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
常用中英文缩写及含义  7-11
第一部分河豚毒素综述  11-28
  1 、河豚  11-12
  2 、河豚毒素  12-26
    2.1 TTX 及其衍生物  12-13
    2.2 TTX 的研究历史  13-14
    2.3 TTX 的分布情况  14-16
    2.4 TTX 的起源  16
    2.5 TTX 的毒性机理  16-18
    2.6 河豚的食用管理  18
    2.7 TTX 中毒的解救方法  18-19
    2.8 TTX 的毒理及药理的研究  19-20
    2.9 TTX 的检测方法  20-26
      2.9.1 生物测定法  20-21
        2.9.1.1 小鼠生物试验  20
        2.9.1.2 其它生物测定方法  20-21
      2.9.2 理化检测方法  21-24
        2.9.2.1 荧光法  21
        2.9.2.2 紫外分光光度法  21-22
        2.9.2.3 薄层色谱法  22
        2.9.2.4 高效液相色谱法  22-23
        2.9.2.5 气相色谱-质谱联机法  23
        2.9.2.6 其它方法  23-24
      2.9.3 免疫化学测定方法  24-26
  3 、河豚经济  26-28
第二部分 TTX的快速检测  28-54
  第一章利用固定化酶检测TTX  28-38
    1 、材料与方法  28-31
      1.1 材料与方法  28-29
        1.1.1 试剂  28-29
        1.1.2 仪器  29
      1.2 OXO的固定化  29
        1.2.1 戊二醛法固定 OXO  29
        1.2.2 过碘酸钠氧化法固定 OXO  29
      1.3 显色剂的配制  29
      1.4 TTX 的检测  29-30
        1.4.1 TTX 的提取  29-30
        1.4.2 标准曲线的制备  30
        1.4.3 样品中TTX的检测  30
      1.5 小鼠生物试验检测TTX  30-31
    2 、结果  31-34
      2.1 结果  31-32
        2.1.1 部分离子及有机物对OXO酶活力的影响  31
        2.1.2 部分离子及有机物对HRP酶活力的影响  31-32
      2.2 存放条件对OXO的酶活力的影响  32
      2.3 酶法检测TTX的标准曲线  32-33
      2.4 河豚肝脏中TTX的含量检测  33
      2.5 该方法与小鼠生物试验的比较  33-34
    3 、讨论  34-37
      3.1 检测原理  34
      3.2 酶反应条件的控制  34-35
      3.3 酶的固定化及其保存  35-36
      3.4 检测干扰  36
      3.5 固定化酶法与小鼠生物试验的对照  36-37
    4 、小结  37-38
  第二章免疫学方法检测TTX  38-51
    1 、材料与方法  39-43
      1.1 材料与试剂  39
      1.2 试验动物  39
      1.3 仪器设备  39-40
      1.4 试验方法  40-43
        1.4.1 免疫抗原(KLH-HCHO-TTX)的合成  40
        1.4.2 包被抗原(BSA-HCHO-TTX)的合成  40
        1.4.3 抗原鉴定  40
        1.4.4 抗血清制备  40-41
          1.4.4.1 免疫BaLB／C小鼠制备TTX抗血清  40-41
          1.4.4.2 免疫新西兰兔制备TTX抗血清  41
        1.4.5 抗血清的效价测定  41
        1.4.6 抗血清的纯化  41-42
          1.4.6.1 抗血清的DEAE-纤维素柱法纯化  41-42
          1.4.6.2 抗血清的辛酸-硫酸铵法纯化  42
        1.4.7 TTX的检测  42-43
          1.4.7.1 TTX的提取  42
          1.4.7.2 间接竞争ELISA法检测TTX的标准曲线制备  42-43
          1.4.7.3 TTX的检测  43
        1.4.8 小鼠生物试验检测TTX  43
    2 、结果与讨论  43-50
      2.1 人工抗原的合成与鉴定  43-45
      2.2 抗血清的效价  45-46
      2.3 抗血清的纯化  46-47
      2.4 抗TTX兔血清的交叉反应率  47-48
      2.5 标准曲线  48-49
      2.6 河豚鱼肝脏中TTX的含量  49
      2.7 TTX的含量及与小鼠生物试验检测结果的比较  49-50
    3 、小结  50-51
  第三章两种快速检测方法的比较研究  51-53
    1 、两种快速检测方法的比较  51
    2 、两种快速检测方法与小鼠生物试验的比较  51-53
  第四章课题结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-59

河豚毒素的快速检测方法研究

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