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莪术细胞悬浮培养，挥发油、多糖分离及其多糖生物学活性研究

作　者: 罗红梅
导　师: 方宏筠
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 植物学
关键词: 莪术 细胞悬浮系 挥发油 多糖 生物学活性
分类号: TQ461
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


摘要: 本研究建立了高产细胞悬浮系，是以莪术黄色、疏松愈伤组织细小颗粒为实验材料，将其接种于不同种类培养基，在不同碳源、氮源、激素种类及浓度、pH值、摇床转速、接种量、继代周期、光暗培养周期等不同条件下，培养一定时期后离心收获细胞，利用水蒸汽法测挥发油含量，苯酚—硫酸法测多糖含量。在挥发油的合成调控中，进行了乙酸铵、乙酸钾、泛酸钙等前体物质及能量物质ATPNa2添加的调控研究。确立了有利于莪术细胞生长及多糖和挥发油合成的最佳培养条件。结果表明，在最佳培养条件下，莪术细胞生长量是未优化培养对照组的1.82倍；悬浮细胞中多糖和挥发油含量大大提高了，分别可达45.53%和2.62%。其中多糖含量是饮片多糖含量的1.37倍，挥发油含量是未优化培养对照组的1.71倍。这方面的研究未见报道。本研究为工业化生产提供有意义的理论依据。在莪术多糖的生物学活性研究中，采用热水浸提法从莪术饮片粉末浸提得粗多糖，经醇析、浓缩、DEAE-52纤维素柱层析，经蒸馏水、NaCl溶液梯度洗脱纯化后，利用琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测，得一水洗脱组分，用该组分进行动物活体内抗肿瘤、免疫及体内外抗氧化研究。实验结果表明：莪术饮片多糖含量为33.12%。莪术多糖具有体内抗H22腹水癌的实体瘤作用，剂量为500mg?kg-1?day-1的抑瘤率高达54.87%，并能提高小鼠的淋巴细胞转化率、脾指数及血液中SOD酶活力；体外具有抗羟自由基氧化的能力，多糖浓度为100mg/mL时，对羟自由基的清除率达36.56%。莪术多糖可能是通过提高小鼠的免疫力及抗氧化能力的途径来抑制H22肿瘤细胞的生长。利用正交实验设计确立了从莪术饮片中同时提取多糖及挥发油的最佳工艺。结果表明：粉碎程度为200目、水浸提４h、1∶20的浸提比的条件下，可以同时获得莪术多糖和挥发油的最大提取量，分别为24.8%和2.21%。

全文目录


中文摘要  7-8
前言  8
第一部分 文献综述  8-16
  1 莪术的自然属性及研究进展  8-11
    1．1 莪术的分类、形态结构及分布状况  8
    1．2 莪术的传统药效、药理研究及在现代医学中的应用  8-10
      1．2．1 莪术调节机体免疫反应．  9
      1．2．2 莪术直接抑制和破坏癌细胞作用  9
      1．2．3 莪术拮抗致癌反应．  9
      1．2．4 莪术遗传毒性．  9-10
      1．2．5 莪术临床应用  10
    1．3 莪术有效成分的研究进展  10-11
      1．3．1 挥发油类  10-11
      1．3．2 微量元素．  11
      1．3．3 多糖类  11
  2 中药活性多糖的研究进展  11-13
    2．1 中药多糖的免疫调节作用  11-12
      2．1．1 对免疫细胞的调节  11
      2．1．2 对补体细胞的调节  11
      2．1．3 对细胞因子的调节．  11-12
    2．2 中药多糖的抗肿瘤作用  12
      2．2．1 对细胞膜组分的影响  12
      2．2．2 对磷脂酰肌醇（PI）转换的影响  12
      2．2．3 对抗癌基因的影响  12
    2．3 中药多糖的抗氧化作用  12-13
    2．4 中药多糖的抗突变功能  13
    2．5 中药多糖的抗溃疡作用  13
    2．6 中药多糖调节心脏功能的作用  13
    2．7 中药多糖的其他作用  13
  3 中药植物细胞培养的研究进展  13-16
    3．1 中药植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展  14-15
    3．2 中药植物细胞培养的展望  15-16
第二部分 高产莪术细胞悬浮系的建立及其合成挥发油的调控．  16-28
  1 材料与方法  16-17
    1．1 材料与培养条件  16-17
      1．1．1 愈伤组织的诱导  16
      1．1．2 悬浮培养条件  16
      1．1．3 高产细胞系的建立  16-17
    1．2 前体物质的添加  17
    1．3 仪器、试剂与分析方法  17
  2 结果与分析  17-27
    2．1 莪术愈伤组织诱导的结果  17-19
      2．1．1 外植体对莪术愈伤组织诱导的影响  17-18
      2．1．2 激素配比对莪术愈伤组织诱导的影响  18-19
      2．1．3 光照对莪术愈伤组织诱导的影响  19
      2．1．4 温度对莪术愈伤组织诱导的影响  19
    2．2 高产莪术细胞悬浮系的形态特征  19
    2．3 莪术悬浮细胞生长及挥发油合成的曲线  19-20
    2．4 碳源对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  20-21
    2．5 氮源对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  21
    2．6 激素对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  21-22
    2．7 光照条件对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  22
    2．8 培养基pH值对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  22-23
    2．9 接种量对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  23
    2．10 摇床转速对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  23-24
    2．11 温度对莪术细胞生长和挥发油含量的影响  24
    2．12 前体及能量物质的添加对莪术细胞生长和挥发油合成的影响  24-26
      2．12．1 不同前体的添加对莪术细胞生长和挥发油合成的影响  24
      2．12．2 不同培养时期添加前体对莪术细胞生长和挥发油合成的影响  24-25
      2．12．3 不同浓度的前体添加对莪术细胞生长和挥发油合成的影响  25-26
    2．13 能量物质添加对莪术细胞生长和挥发油合成的影响  26-27
  3 讨论  27-28
    3．1 影响建立莪术高产细胞悬浮系的因素  27
    3．2 莪术挥发油合成调控机理的探讨  27-28
第三部分 莪术悬浮细胞系合成多糖的调控研究  28-35
  1 材料与方法  28
    1．1 材料与试剂  28
    1．2 方法  28
      1．2．1 细胞悬浮培养  28
      1．2．2 细胞生长量测定  28
      1．2．3 多糖的提取、测定  28
      1．2．4 多糖含量测定  28
        1．2．4．1 标准曲线的制作  28
        1．2．4．2 多糖含量测定方法  28
  2 结果与分析  28-34
    2．1 培养基成分对莪细胞生长量和多糖含量的影响  28-29
    2．2 碳源对细胞生长量和多糖含量的影响  29-30
    2．3 氮源对细胞生长量和多糖含量的影响  30-31
    2．4 激素对细胞生长量和多糖含量的影响  31-32
    2．5 接种量对细胞生长量和多糖含量的影响  32
    2．6 继代周期对细胞生长量和多糖含量的影响  32-33
    2．7 pH值对细胞生长量和多糖含量的影响  33-34
    2．8 摇床转速对细胞生长量和多糖含量的影响  34
    2．9 光照培养对细胞生长量和多糖含量的影响  34
  3 讨论  34-35
第四部分 莪术多糖的分离提取及其生物学活性研究  35-49
  1 材料与方法  35-38
    1．1 实验材料  35
    1．2 试剂  35
    1．3 多糖的提取及含量的测定  35
    1．4 莪术多糖的分离提取、纯化  35-36
      1．4．1 莪术多糖的醇析  35-36
      1．4．2 多糖除色素  36
      1．4．3 多糖除蛋白  36
      1．4．4 多糖的DEAE-52柱层析  36
      1．4．5 纯度检测  36
        1．4．5．1 琼脂糖凝胶电泳  36
        1．4．5．2 纸层析．  36
      1．4．6 蛋白质含量的检测  36
    1．5 莪术多糖体内抗肿瘤实验．  36-37
      1．5．1 实验动物及瘤株  36
      1．5．2 小鼠H22肝癌腹水瘤细胞接种．  36-37
      1．5．3 莪术多糖的给药方式及分组  37
      1．5．4 抑瘤率和体重变化率的计算  37
    1．6 莪术多糖体内免疫功能实验  37
      1．6．1 材料  37
      1．6．2 方法  37
        1．6．2．1 血液中淋巴细胞的分离及其转化率的计算  37
        1．6．2．2 脾指数的测定  37
    1．7 莪术多糖体内抗氧化实验  37-38
      1．7．1 材料  37
      1．7．2 邻苯三酚（PR）法测定血液中SOD活性  37-38
        1．7．2．1 试剂  37
        1．7．2．2 实验步骤  37-38
    1．8 莪术多糖体外抗氧化实验  38
      1．8．1 材料  38
      1．8．2 Fenton法测定莪术多糖抗羟自由基活性．  38
        1．8．2．1 羟自由基的产生——Fenton反应  38
        1．8．2．2 羟自由基的测定  38
        1．8．2．3 羟自由基清除率的计算  38
    1．9 从莪术中同时提取多糖和挥发油的最佳条件的确立  38
    1．10 数理统计分析  38
  2 结果与分析  38-47
    2．1 莪术多糖提取条件确立的实验结果  38-39
    2．2 莪术多糖性质的检测  39
    2．3 莪术多糖的分离提取、纯化的实验结果  39-42
      2．3．1 莪术多糖的醇析结果  39
      2．3．2 除色素方法的比较结果  39-40
      2．3．3 Savage法除蛋白的实验结果  40
      2．3．4 莪术多糖的DEAE-52柱层析的实验结果  40-41
      2．3．5 莪术多糖的琼脂糖凝胶电泳检测结果  41
      2．3．6 莪术不同器官多糖含量的测定结果  41
      2．3．7 纸层析检测结果  41-42
    2．4 莪术多糖体内抗肿瘤实验  42-43
      2．4．1 莪术多糖的注射给药及口服给药对小鼠H22肝癌腹水瘤的抑制作用  42-43
    2．5 莪术多糖体内免疫功能实验  43-44
      2．5．1 莪术多糖对H22荷瘤小鼠脾指数和淋巴细胞转化的影响  43-44
    2．6 莪术多糖体内抗氧化实验  44
      2．6．1 莪术多糖对H22荷瘤小鼠血液SOD活性的影响  44
    2．7 莪术多糖体外抗氧化实验  44-46
      2．7．1 不同材料相同醇析级份的多糖抗羟自由基的能力比较  44-45
      2．7．2 莪术多糖浓度对清除羟自由基的影响  45-46
    2．8 从莪术中同时提取多糖和挥发油的最佳条件确立的实验结果  46-47
  3 讨论  47-49
    3．1 莪术多糖的提取、纯化工艺的研究  47
    3．2 莪术多糖与莪术次生代谢物——挥发油的关系  47
    3．3 莪术多糖生物学活性机理的探讨  47-49
结论  49-50
英文摘要  50-51
参考文献  51-55
致谢  55

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 中草药制剂的生产
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