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血吸虫抗独特型抗体NP30 6×V_HCDR3/hIL-2融合基因的构建及表达

作　者: 徐玮
导　师: 冯振卿
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理学
关键词: 日本血吸虫疫苗杭独特型杭体可变区基因聚合酶链反应白细胞介素-2 融合基因保护性免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。我国血吸虫病防治工作取得了很大成就，但在某些疫区，血吸虫病流行仍较严重，灭螺效果难以持久和巩固，并可能造成生态环境污染，长期扩大化疗，有产生抗药性的危险。作为药物防治和其他措施的必要补充，血吸虫病疫苗的研究就显得十分必要。由于大部分日本血吸虫的保护性抗原含有糖基或糖类，用基因工程技术难以制备。因此，抗独特型抗体(anti-id)疫苗的研究日益受到重视。管晓虹等建立了一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体，命名为NP30。经鉴定抗体同型为IgM，为肠相关抗原(GAA)的内影像anti-id，与可溶性虫卵抗原(SEA)及膜相关抗原(MAA)有交叉反应，可替代虫源性抗原用于血吸虫病免疫诊断和抗病疫苗的研究。用NP30主动免疫小鼠、山羊，可产生较好的免疫保护作用，具有抗感染免疫和抗病免疫的双重功效，为一有希望的血吸虫病疫苗候选分子。但NP30为鼠源性单抗，作为异种蛋白用于人体可引起免疫反应，产生人抗小鼠抗体(HAMA)，有可能中和继之接种的疫苗，或诱发过敏反应，因而有必要对NP30进行人源化改造。本课题组已证明V_HCDR3区的10个氨基酸为其可能的抗原位点，设计开构建了NP30V_HCDR3区6倍重复表位基因序列(6×V_HCDR3)，在此基础上，本文扩增了NP30 6×V_HCDR3基因，与hIL-2基因整合表达融合蛋白，并进行了动物保护性试验。研究方法 1．根据本课题组设计的NP30 6×V_HCDR3基因序列及文献已发南京医科大学硕士学位论文表的hIL一2基因序列分别设计一对引物，为便于克隆和表达，在引物两端引进合适的酶切位点和保护性碱基。分别以质粒pFUW8o一6XVHCDR3、pssK一I为模板，进行聚合酶链反应(pCR)。扩增产物纯化后，将其克隆入pucm一T vector，挑选阳性克隆测序。 2.将通过PCR方法体外扩增并经测序验证的NP3O 6xVHCDR3和hIL一2基因，先后重组入原核表达载体pET-28a(+)相应的位点上，构建成 pET-28a(+)一6xvHeDR3/h IL一2表达载体。 3.通过重组克隆的筛选，将构建正确的融合基因表达载体转化E.。011 BLZI，IPTG诱导表达，sDs一队GE确定分子量和产量，并将表达产物初步纯化。 4.36只BALB/e小鼠(6一s周龄，体重18一209)随机分成3组，每组12只。第一组为对照组，第二组为融合蛋白组，第三组为NP3O组。在0，2，4周分三次免疫，实验组每鼠腹腔注射融合蛋白100林l(200协留ml):NP3O组每鼠腹腔注射Np3o 100林l(200林g/ml):对照组于每只刁、鼠腹腔注射生理盐水100闪。最后一次免疫后二周，尾坳腹部皮肤攻击感染，28天后处死小鼠。经门脉灌注，计数每只小鼠的虫荷，计算减虫率。研究结果 1.PcR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见20obP及400 bp特异性条带，与预期大小一致。序列测定结果表明，NP3 0 6xvHcDR3基因全长180 bp，编码60个氨基酸残基:hIL一2基因全长399 bp，编码133个氨基酸残基，有一个链内二硫健(Cys58一Cys 105)。 2.表达质粒经杭生素杭性、蓝白斑筛选、PCR及行Ec口Rl、Hl’nd111/Hl’nd 111、筋01/EcORI、双01三组双酶切，可见预期大刁·的片段，经测序验证表明重组成功。 3.融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白，SDS一队GE分析分子量约为30 KD，表达量约占菌体总蛋白的20%。融合蛋白经初步纯化南京医科大学硕士学位论文后，浓度为1.39/L。 4.融合蛋白主动免疫BALB/c小鼠可诱导48.5%的减虫率(t检验p<0.0一)。结论1.成功克隆了日本血吸虫单克隆抗独特型杭体NP3o 6xVI，cDR3基因及hIL一2基因。2，正确构建了NP3 0 6xVI不DR3/IL一2融合基因并表达融合蛋白。3.融合蛋白主动免疫BALB/c，J、鼠对血吸虫尾坳攻击可诱导较好的免疫保护作用。

全文目录

1 中文摘要  3-6
2 英文摘要  6-10
3 前言  10-16
4 材料与方法  16-28
5 结果  28-35
6 讨论  35-42
7 研究小结  42-43
8 附录  43-44
9 致谢  44-45
10 综述:抗独特型抗体疫苗研究进展  45-57

血吸虫抗独特型抗体NP30 6×V_HCDR3/hIL-2融合基因的构建及表达

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