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人Lipocalin型前列腺素D合成酶的真核表达及单克隆抗体的制备

作　者: 高云
导　师: 黄宇烽
学　校: 南京医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 前列腺素D合成酶酵母表达系统金属亲和层析糖基化视黄酸单克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

Lipocalin型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS）亦称β-trace protein，是机体组织屏障的主要成分，属Lipocalin家族。Lipocalins为一组分子量较小的分泌性蛋白质，它们的共同特性是可结合和运输亲脂／疏水分子，L-PGDS为此家族中惟一有酶活性者。L-PGDS主要分布于哺乳动物的中枢神经系统和雄性生殖器官，并分泌至脑脊液、血清、精液、尿液、羊水等体液中。L-PGDS是一种双功能蛋白，除催化PGD₂产生外，亦可结合和运输亲脂／疏水分子。该蛋白具有广泛的生理学作用，它不仅与睡眠诱导、体温调节、感受伤害、气味应答有关，亦是一种生育相关蛋白，可能参与精子的发生和成熟。研究显示，对于一些神经系统疾病、肾脏疾病、心血管疾病、生殖系统疾病等，L-PGDS已成为一个有用的诊断指标。为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机制以及与男性不育的关系等，就必须得到大量的纯化L-PGDS抗原和相应的抗体。本研究第一部分首先用PCR的方法从质粒pGEX-2T／htL-PGDS上扩增出人睾丸L-PGDS成熟肽基因编码序列，克隆至T载体。测序结果表明，PCR扩增的DNA片段与所报道的人睾丸L-PGDS cDNA完全一致。然后用EcoRⅠ、NotⅠ分别对克隆有L-PGDS的质粒pGEM-T／htL-PGDS和酵母表达质粒pPIC9进行双酶切，T4连接酶将L-PCDS基因片段与线性化的pPIC9连接，构建了真核表达载体pPIC9／htL-PGDS。在第二部分试验中，BglⅡ将重组质粒pPIC9／htL-PGDS线性化后，电穿孔法将其导入巴斯德毕赤氏酵母GS115。菌落PCR对酵母转化菌进行鉴定后，甲醇诱导重组蛋白的表达，结果得到一株L-PGDS表达阳性克隆，M_r约为27000，与理论值完全一致。培养上清经SDS-PAGE电泳后，进行薄层扫描分析，南京医科大学硕士学位论文M为 27 000的 LPGDS的含量约占酵母培养上清中总蛋白含量的 18o。Bradford法测定培养上清的总蛋白含量约为 150mg／L，因此，重组 LPGDS的表达量可达27mg／L左右。本文第三部分通过镍离子金属亲和层柱对重组卜阳m进行了纯化，并用糖旮酶 F对其进行了消化。结果表明，通过Plthlti Pastorlj系统表达的重组蛋白除 M为 27 000勺主带卜，尚存在 M为 24 000、ZI 000的两条弱带，这两条弱带为糖基化不完全所致。纯化蛋白与视黄酸结合后，其紫外吸收波谱发生红移，证实重组 LPGDS具有生物学活性。Western blotting分析亦表明重组 LPGDS可与兔抗人 LPGDS多克隆抗体发生特异结合。第四部分采用杂交瘤技术，将骨髓瘤细胞SPZ川与分。必LIGDS抗体的小鼠脾细胞融合成杂交瘤细胞，利用瘤细胞无限增殖及免疫细胞分泌抗体的能力大量制备针对LPGDS抗原的MCAb。首先以重组LPGDS作为抗原免疫－BALB止小鼠；免疫成功后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，通过阳性克隆有限稀释法；得到一株 Ig＊类 LIGDS McAb；再将生长良好的杂交瘤细胞接种到石蜡油预处理的 BALB七小鼠腹腔中，制备腹水型抗人LPGDSMCAb。酶联免＆吸附试验汪LISA)证明其滴度可达 1：5＼ l：5’；WesternElotting鉴定表明该 McAb能特异性地结合精浆中 M为 27 000的L－PGDS。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
引言  10-13
第一部分 Lipocalin型前列腺素D合成酶真核表达载体的构建  13-21
  1 材料和方法  13-17
    1.1 实验材料、仪器和试剂  13-14
    1.2 引物设计与合成  14
    1.3 测序载体的构建及鉴定  14-15
      1.3.1 PCR扩增L-PGDS基因片段  14-15
      1.3.2 测序载体pGEM-T/htL-PGDS的构建  15
      1.3.3 鉴定和序列分析  15
    1.4 pPIC9/htL-PGDS重组表达质粒的构建  15
    1.5 重组质粒的鉴定  15-17
  2 结果  17-19
    2.1 L-PGDS的扩增结果  17
    2.2 测序载体的构建和序列分析  17-19
    2.3 L-PGDS真核表达载体的构建  19
  3 讨论  19-21
第二部分 L-PGDS酵母表达菌株的建立  21-29
  1 材料和方法  21-26
    1.1 主要实验材料、仪器和试剂  21-22
    1.2 主要试剂配制  22-23
      1.2.1 贮存液的配制  22
      1.2.2 培养基的配制  22-23
    1.3 待转化DNA的制备  23-24
      1.3.1 质粒pPIC9/htL-PGDS和pPIC9的线性化  23
      1.3.2 乙醇沉淀回收DNA  23-24
    1.4 感受态酵母细胞的制备  24
    1.5 L-PGDS基因的电转化  24
    1.6 酵母转化菌的鉴定  24
    1.7 表型的鉴定  24-25
    1.8 L-PGDS表达阳性克隆的筛选  25
    1.9 不同诱导时间重组L-PGDS的表达  25
    1.10 表达量的初步分析  25-26
  2 结果  26-28
    2.1 质粒pPIC9/htL-PGDS的酵母转化  26
    2.2 表型鉴定  26-27
    2.3 表达阳性克隆的筛选  27
    2.4 不同诱导时间重组L-PGDS的表达  27
    2.5 表达量的初步分析  27-28
  3 讨论  28-29
第三部分 L-PGDS的大规模诱导表达、纯化和鉴定  29-36
  1 材料和方法  29-32
    1.1 主要实验材料、仪器和试剂  29-30
    1.2 L-PGDS的大规模诱导表达  30
    1.3 重组蛋白质的纯化  30-31
      1.3.1 硫酸氨沉淀法浓缩酵母培养上清  30
      1.3.2 镍离子亲和层析  30-31
    1.4 L-PGDS糖链的水解  31
    1.5 纯化蛋白的生物学活性检测  31
    1.6 重组L-PGDS的免疫印迹  31-32
  2 结果  32-34
    2.1 L-PGDS的表达、纯化  32
    2.2 重组L-PGDS的糖基化分析  32-33
    2.3 重组L-PGDS的生物学活性  33-34
    2.4 重组L-PGDS的Western印迹  34
  3 讨论  34-36
第四部分分泌L-PGDS单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定  36-44
  1 材料与方法  36-40
    1.1 主要实验材料、仪器和方法  36-37
    1.2 免疫脾细胞制备  37
      1.2.1 免疫BALB／c小鼠  37
      1.2.2 制备免疫脾细胞悬液  37
    1.3 饲养细胞的制备  37
    1.4 细胞融合  37-38
    1.5 杂交瘤细胞观察及换液  38
    1.6 分泌L-PGDS McAb阳性克隆的检测  38
    1.7 阳性克隆有限稀释  38-39
    1.8 腹水型单克隆抗体的制备  39
    1.9 单克隆抗体的鉴定  39-40
      1.9.1 单克隆抗体亚类测定  39
      1.9.2 效价测定  39
      1.9.3 特异性鉴定  39-40
        1.9.3.1 L-PGDS McAb与精浆中L-PGDS的蛋白印迹  39-40
        1.9.3.2 L-PGDS McAb与重组L-PGDS的蛋白印迹  40
        1.9.3.3 免疫阻断试验  40
  2 结果  40-42
    2.1 杂交瘤细胞株的建立  40
    2.2 单克隆抗体亚类测定结果  40-41
    2.3 L-PGDS McAb的效价测定结果  41
    2.4 特异性鉴定  41-42
      2.4.1 L-PGDS McAb与精浆中L-PGDS的蛋白印迹  41-42
      2.4.2 L-PGDS McAb与重组L-PGDS的蛋白印迹  42
      2.4.3 免疫阻断试验结果  42
  3 讨论  42-44
小结  44-45
参考文献  45-49
研究生期间主要学术成果  49-50
致谢  50-51
综述及参考文献  51-58

人Lipocalin型前列腺素D合成酶的真核表达及单克隆抗体的制备

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