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人C5a反义肽的分子设计及其功能研究

作　者: 巫振洪
导　师: 吴玉章；吕凤林
学　校: 第三军医大学
专　业: 免疫学
关键词: 过敏毒素C5a 反义肽生物分子相互作用分析亲和力 BIA技术急性肺损伤黏附分子血管内皮细胞中性粒细胞
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

过敏毒素C5a是补体活化、裂解的产物，具有黏附分子调节及免疫调节作用。同时，作为机体一种重要的前炎症介质，其参与了许多疾病的病理过程，并对这些疾病的发生、发展起重要作用。因此，阻断C5a与C5aR的结合，抑制C5a过敏毒素的生物学效应，将对ALI、ARDS及其它C5a相关疾病的预防和治疗起到积极的推动作用。目前，这方面的研究主要集中在C5a单抗及C5a抗血清。本研究以正、反义肽的选择性相互作用的理论为依据，从反义肽分子设计的角度寻找可中和C5a过敏毒素的拮抗多肽。主要的研究内容包括以下几个方面：（1）采用亲水性方案、可塑性方案及可及性方案，对C5a与C5aR结合的功能结构区域进行分析，结果显示：C5a的功能结构区域主要位于氨基端第1～8位，核心区第28～39位及羧基端第65～70位的氨基酸残基。（2）根据上述C5a功能结构区域的分析结果，结合Baranyi等关于C5a与C5aR分子间作用最强的反义同源盒区（LR3、LR4）序列，确定C5a分子两个功能结合位点区域在第28～40位和第61～74位，分别命名为正义肽L1和L2；按照反义肽分子设计的模型，设计并合成了对应于上述两条正义肽的共四条反义肽，具体序列如下：正义肽L1：V²⁸NNDETCEQRAAR⁴⁰。其对应的反义肽为：反义肽R1：QLLLLWTLDARRA 反义肽R2：PCSSQLTGFIIIN 正义肽L2：L⁶¹RANISHKDMQLGR⁷⁴其对应的反义肽为：反义肽R3：PSQLHVFMRDISTE 反义肽R4：EARLQRVFLYVNPS （3）采用生物分子相互作用分析（BIA）技术筛选可与csa发生选择性相互作用的反义多肤，并进一步研究其分子间相互作用的结合动力学。结果显示:在上述4条反义肤中，只有一条反义肤（R4）与csa全长分子及正义肤LZ间存在选择性相互作用，其解离平衡常数值（Ko）分别为6.62K10一6M和4 .508 x1O6M。（4）通过体外细胞实验，研究反义肤R4对Csa介导的VEC与P入IN粘附的影响。结果显示:当反义肤R4的浓度为1000 ng/ml时，勃附分子P一Seleetin的表达同单纯Csa刺激组相比出现显著性差异，P一Seleetin表达的阳性细胞率明显降低;当其浓度达so00ng/ml时，vEc上P一Selectin表达量达最低，其表达量可下降20%左右;若进一步增加R4的浓度，P一Selectin表达量再无明显下降。同时，通过检测VEC上豁附的PM…N中MPO的活性，间接反映VEC与PNfN间豁附性的强弱，结果表明:当反义肤R4的浓度为1000ng/ml时，VEC上砧附pMN中MpO的活性同单纯csa刺激组相比出现显著差异（P<0.05）;当反义肤R4的浓度增加至500。ng/ml，VEC一L勃附的PM刊数量最少，同单纯Csa刺激组相比相差非常显著（P<0.01），其淤。的活性由1 .16Xlo，uzwell下降至o.71Xlo，u/well，降低达40%左右。（5）采用夹心ELI SA法，测定和比较正常人及发生AIJI后病人血清中Csa的含量;通过流式细胞术，检测ALI病人血清作用后VEC表面戮附分子:P选择素（P一Selectin）和细胞间勃附分子（ICAM一l）的表达变化;同时检测了粘附于血管内皮细胞表面的PMN中MPO活性，以间接反映血管内皮细胞表面PMN的勃附和聚集。结果显示:ALI病人血清中Csa含量明显升高，其平均值为47.2ng/Ml，同正常组比较相差非常显著（P<0.01）;ALI病人血_清刺激后血管内皮细胞表面P一Selectin的表达迅速增加，20min达到高峰，60min后开始降低;ICAM一1的表达较慢，3h开始升高，12h达到最高值，24h内无明显下降，仍维持在较高水平;血管内皮细胞表面粘附的PNIN中MPO的活性，3h明显升高，12h后达到最高值。结论:（1）根据对人Csa与CsaR结合的功能结构区域进行分析的结果，结合Csa分子的二级结构分析，认为Csa与CsaR结合的主要功能结合位点应位于梭基端第61一74位和核心区域第28一40位氨基酸残基。（2）采用生物分子相互作用分析（BIA）技术证实:按照反义肚分子设计的MBB模型，设计、合成的Csa反义肤与Csa及其正义肤分子间确实存在选择性相互作用;筛选获得一条可与Csa全长分子及正义肤LZ发生选择性相互作用的反义多肤（R4），其与Csa分子间相互作用的解离平衡常数值（KD）为6.62X10一6M，与其正义肤LZ分子间的丸为4.508xlo一6M，符合文献报道的弱亲和力生物分子间相互作用的基本规律。（3）体外细胞实验表明:反义肤R4可以剂量依赖关系拮抗Csa介导的VEC表面豁附分子P一Selectin的表达，减少VEC上豁附PMN的数量，其拮抗效率在20%到40%之间。另外，估计反义肤R4与Csa分子间的计量配比关系应在2一10之间。其作用的机制为:Csa反义肤选择性结合于Csa，从而有效地阻断Csa与CsaR的结合，对Csa过敏毒素的生物学活性发挥拮抗作用。（4） ALI后由于Csa含量的升高，血管内皮细胞表面豁附分子:P一Selectin和ICA人1一1等表达的上调，致使大量PMN在肺微血管内扣押、聚集进而同肺血管内皮细胞发生粘附，促进了ALI及ARDS的发生、发展。尽管八击1的发生是诸多因素在多个环节共同作用的结果，但本研究的结果对于过敏毒素Csa在A工1形成中的始动因素地位机制是一个有力佐证，将有助于对ALI发病机理的阐明，同时也为以补体Csa为靶向，

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英文缩略词表  3-5
氨基酸表  5-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
论文正文人C5a反义肽的分子设计及其功能研究  13-69
  前言  13-18
  第一章 C5a分子的功能位点分析  18-24
  第二章 C5a反义肽的分子设计  24-29
  第三章 C5a功能位点正义肽及其反义肽的合成  29-35
  第四章 C5a正义肽与反义肽的分子结合动力学分析  35-45
  第五章 C5a反义肽对VEC与PMN粘附的影响  45-53
  第六章 ALI病人血清对VEC依赖性粘附的影响  53-61
  结论  61-62
  致谢  62-63
  参考文献  63-69
文献综述一反义肽的设计及其在疾病治疗中的应用  69-77
  参考文献  75-77
文献综述二补体靶向治疗研究进展  77-85
  参考文献  83-85
文献综述三 SEREX技术筛选肿瘤抗原研究进展  85-97
  参考文献  94-97
研究生期间发表的论文  97

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