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烧伤脓毒症骨骼肌蛋白降解增强的机制研究

作　者: 申传安
导　师: 柴家科
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 外科学
关键词: 烧伤 脓毒症 蛋白降解 骨胳肌 肌管 基因表达 蛋白表达 泛素 糖皮质激素 肿瘤坏死因子-α 离体孵育 细胞培养 高效液相色谱分析 印迹法 RNA 免疫组织化学 放射免疫
分类号: R644
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


烧伤脓毒症是重症烧伤常见而严重的并发症之一，其来势凶猛，病程进展快，常并发MODS，若得不到及时有效的防治，病死率较高。负氮平衡是烧伤脓毒症时蛋白降解增强的重要代谢特征，占机体细胞干重50％强的骨骼肌蛋白高分解代谢是负氮平衡的主要原因之一。但目前烧伤脓毒症时骨胳肌蛋白高分解代谢的机制尚未完全阐明。 研究目的 我们既往的研究发现，烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白降解率与血内糖皮质激素以及TNF(肿瘤坏死因子)-α、白细胞介素(IL)-6等炎性介质的浓度关系密切。此外，机体细胞内有多种蛋白降解途径，那种途径在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢中扮演主要角色呢?泛素系统是近年来新发现的蛋白降解途径，目前研究认为该系统在骨骼肌蛋白高分解代谢中有重要作用。我们的实验也发现，烧伤脓毒症大鼠骨骼肌内泛素系统的基因和蛋白表达显著增强。基于以上研究，本实验试图通过动物实验、离体组织孵育、细胞培养和临床观察四个方面，进一步探讨糖皮质激素、炎性介质以及泛素系统在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢中的作用及其分子生物学机制。 材料和方法 1．动物实验 (1) 分别给正常大鼠注射不同剂量的地塞米松或TNF-α，离体孵育伸趾长肌，高效液相色谱法测定总蛋白和肌纤维蛋白降解率，核糖核酸印迹法和免疫组织化学染色法分析泛素系统的基因和蛋白表达变化。 (2) 使用含有TNF-α的孵育液，离体孵育大鼠伸趾长肌，分析蛋白降解率以及泛素系统的基因和蛋白表达变化。 (3) 建立大鼠烧伤脓毒症模型，结合使用糖皮质激素拮抗剂 漱 要 军医进修学院硕土论文 RU朋486干预，分析骨骼肌蛋白降解率以及泛素系统的基因和蛋白表 达变化。通过放免法测定血内皮质醇和炎性介质浓度变化。 2．骨骼肌细胞培养 （1）建立稳定的大鼠骨骼肌细胞离体培养增殖、融合方法。 （2）L－「3，5－3H卜酪氨酸标记肌管蛋白合成。 （3）使用含有不同浓度地塞米松或TNF－口的培养液，井结合使 用蛋白酶体抑制剂MG 32培养肌管，于不同时间点收集标本。液闪 计数仪测定肌管卜【3，5－3H卜酪氨酸的释放量，计算短寿命、长寿命 蛋白降解率。分析肌管内泛素系统的基因表达变化。 3．临床部分采集患者（9例大面积烧伤病人，9例整形待手 术患者）的骨骼肌（肪二头肌、股四头肌）以及血、尿标本，检测 血内皮质醇和炎性介质浓度以及尿内3－甲基组氨酸含量变化，分析 骨骼肌内泛素系统的基因和蛋白表达变化。 一 1．糖皮质激素与骨骼肌蛋白代谢 山地塞米松能显著增强大鼠骨骼肌泛素系统基因和蛋白的表 达以及骨骼肌总蛋白，特别是肌纤维蛋白的降解率，在一定范围内， 此作用呈剂量依赖关系。糖皮质激素受体桔抗剂RU38486能阻断此 作用。 （2）糖皮质激素受体桔抗剂RU38486能显著抑制烧伤脓毒症大 鼠骨骼肌泛素系统基因和蛋白的表达，降低骨骼肌蛋白降解率。 （3）地塞米松能上调肌管内泛素系统的基因表达，增强肌管蛋白 降解率，此效应在一定范围内呈剂量依赖关系。蛋白酶体抑制剂 MG 32能阻断地塞米松对肌管蛋白降解率的增强作用。 2．TNP与骨骼肌蛋白代谢 ＊）静脉注射TNF－a能上调骨骼肌泛素系统的基因和蛋白的表 达，增强大鼠骨骼肌蛋白降解，而此作用能被糖皮质激素受体桔抗 剂RU38486部分阻断，提示TNF－Q增强骨骼肌蛋白降解的作用在一 定程度上是由糖皮质激素所介导。 3 粉 要 军医进修学院硕士论文 C 离体孵育实验发现，TNF－口能直接作用于骨骼肌组织，增强 泛素蛋白酶体途径的活性，但TNF－a能否直接增强骨骼肌蛋白分解 代谢尚有待进一步探讨。 ＊细胞培养实验发现，TNF－口既能上调肌管内泛素系统的基因 表达，也能增强肌管蛋白降解率，蛋白酶体抑制剂MG132能阻断TNF－ a对肌管蛋白降解率的增强作用。

全文目录


英文缩写一览表  7-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
第一部分 糖皮质激素与TNF在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白降解增强中作用的机制研究  15-55
  材料和方法  15-30
    1． 主要实验仪器  15
    2． 主要试剂及配制  15-19
    3． 实验动物模型及分组  19-20
    4． 样品采集及初步处理  20
    5． 骨骼肌离体有氧孵育  20-21
    6． 指标检测及方法  21-30
      6．1 血浆内皮质醇及炎性介质测定  21
      6．2 骨骼肌蛋白降解率测定  21-24
      6．3 骨骼肌组织泛素系统基因表达分析  24-30
      6．4 免疫组化分析骨骼肌组织泛素及泛素化蛋白的表达  30
      6．5 统计学处理  30
  实验结果  30-37
    1． 糖皮质激素在大鼠骨骼肌蛋白降解中的作用及机制探索  30-32
      1．1 地塞米松对大鼠骨骼肌蛋白代谢的影响  30-31
      1．2 地塞米松对大鼠骨骼肌泛素（Ub）基因表达的影响  31-32
      1．3 地塞米松对大鼠骨骼肌泛素（Ub）蛋白表达的影响  32
    2． 糖皮质激素在烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白降解中的作用及机制  32-35
      2．1 烧伤脓毒症大鼠血内皮质醇变化  32
      2．2 RU38486对烧伤脓毒症大鼠EDL重量的影响  32-33
      2．3 RU38486对烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白降解率的影响  33
      2．4 RU38486对烧伤脓毒症大鼠骨骼肌泛素系统mRNA表达的影响  33-34
      2．5 RU38486对烧伤脓毒症大鼠骨骼肌泛素蛋白表达的影响  34-35
    3． TNF在大鼠骨骼肌蛋白降解中的作用及机制探索  35-37
      3．1 正常大鼠静脉注射TNF后体温变化  35
      3．2 大鼠伸趾长肌重量的变化  35
      3．3 静脉注射TNF对大鼠伸趾长肌蛋白降解率的影响  35
      3．4 静脉注射TNF对大鼠伸趾长肌内泛素系统基因表达的影响  35-36
      3．5 静脉注射TNF后大鼠伸趾长肌内泛素蛋白表达的变化  36
      3．6 TNF对离体孵育的大鼠伸趾长肌蛋白降解率的影响  36-37
      3．7 TNF对离体孵育的大鼠伸趾长肌内泛素系统基因表达的影响  37
  讨论  37-45
  小结  45-46
  参考文献  46-49
  照片1  49-55
第二部分 骨骼肌细胞的离体培养及糖皮质激素和炎性介质调节肌管蛋白降解的分子生物学机制  55-82
  材料和方法  55-63
    1． 主要试剂及耗材  55-57
    2． 主要实验仪器  57-58
    3． 骨骼肌肌管离体培养  58-60
      3．1 卫星细胞的分离与培养  58-60
      3．2 卫星细胞融合形成肌管  60
      3．3 卫星细胞及肌管的鉴定  60
    4． 同位素标记肌管内长寿命蛋白  60
    5． 实验分组  60-62
    6． 标本收集及指标检测  62-63
      6．1 培养液标本  62
      6．2 细胞收集  62
      6．3 L-[3，5-~3H]-酪氨酸含量测定  62
      6．4 骨骼肌组织泛素系统基因表达分析  62-63
      6．5 统计学处理  63
  实验结果  63-66
    1． 蛋白酶体抑制剂MG132对肌管蛋白降解的影响  63
    2． 糖皮质激素对肌管蛋白降解的影响  63-64
    3． 糖皮质激素对肌管内泛素系统基因表达的影响  64
    4． TNF对肌管蛋白降解的影响  64-65
    5． TNF对肌管内泛素系统基因表达的影响  65-66
  讨论  66-72
  小结  72-73
  参考文献  73-75
  照片2  75-82
第三部分 重症烧伤病人骨骼肌蛋白代谢变化及其机制分析  82-95
  材料和方法  82-86
    1． 主要试剂及配制  82-83
    2． 主要实验仪器  83-84
    3． 实验对象及分组  84
    4． 标本采集及初步处理  84-85
    5． 指标检测  85-86
      5．1 血浆内皮质醇及炎性介质测定  85
      5．2 骨骼肌蛋白降解测定  85
      5．3 骨骼肌组织泛素系统基因表达分析  85
      5．4 免疫组化分析骨骼肌组织泛素及泛素化蛋白的表达  85
      5．5 统计学处理  85-86
  实验结果  86-87
    1． 血内皮质醇与炎性介质的变化  86
    2． 尿内3-MH排出量  86
    3． 骨骼肌泛素系统基因表达的变化  86-87
    4． 骨骼肌泛素蛋白表达的变化  87
  讨论  87-90
  小结  90-91
  参考文献  91-93
  照片3  93-95
附录： 文献综述  95-122
  综述1：  95-103
  综述2：  103-109
  综述3：  109-116
  综述4：  116-122
研究生期间撰写论文  122-124
致谢  124

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 创伤外科学 > 烧伤及烫伤（灼伤）
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