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骨髓间充质干细胞向神经元方向诱导分化及其机制的实验研究

作　者: 李建杰
导　师: 王相利
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞 Notch信号神经元细胞基因表达
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:通过体外实验探讨β-巯基乙醇(β-ME)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元细胞方向诱导分化的作用,并对Notch信号通路在此诱导分化过程中的作用进行研究,从而为阐明MSCs定向诱导分化为神经元细胞相关机制提供理论及实验依据。方法:1.骨髓间充质干细胞的分离和培养:成年雄性SD大鼠,于无菌条件下取双侧股骨和胫骨,剪除骨两端,用5ml L-DMEM冲洗骨髓腔,将含有骨髓的冲洗液经Percoll分离液离心分离,计数细胞调整密度,按1×109/L接种于培养瓶中,50 ml/L(体积分数)二氧化碳,37℃温箱中培养。倒置相差显微镜下观察原代、传代细胞的形态变化及生长状态。2.骨髓间充质干细胞的诱导分化:细胞传至第5代后按照Woodbury方案进行预诱导和诱导。加入L-DMEM+1mmol/Lβ-ME+20%FBS预诱导24小时后,加入L-DMEM+5mmol/Lβ-ME进行正式诱导。按照不同的诱导时间分为3组:A组:单纯培养对照组;B组:正式诱导1小时组;C组:正式诱导5小时组。在倒置相差显微镜下对诱导前后细胞进行观察、照相。3.神经元细胞的鉴定:对诱导前后细胞进行免疫组织化学SP法检测神经前体细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和神经巢蛋白(Nestin)的表达,以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性,未着色为阴性。4. MSCs诱导后的超微形态结构观察:应用透射电镜对诱导5h后的MSCs进行观察,并对比诱导前后MSCs各细胞器的变化。5. MSCs诱导前后神经元特异表型蛋白的检测:分别提取三组细胞的总蛋白,用westernblot方法检测三组细胞NSE和NESTIN蛋白在诱导前后的表达变化。6. Notch信号通路的检测:参照Trizol试剂说明书提取各组诱导前后细胞的总RNA,测定提取总RNA的纯度,采用Realtime-PCR测定三组细胞的Notch1、jagged1、Hes1、Hes5 mRNA的表达水平,建立Excel数据表应用SPSS13.0软件进行统计学处理。结果:1.各组MSCs贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形。传代后细胞形态和原代细胞相似,生长加快。2. MSCs经诱导后细胞形态变化明显,胞体收缩成锥形、球形,突起增多,表现出神经元细胞样形态。诱导后5小时具有神经元细胞形态特点的细胞数量逐渐增多,形成双极或多极细胞,而且细胞的多个突起发出分支,相互交织成网,此时形态也不再发生明显改变,具有典型的神经元细胞样形态。3.诱导后细胞神经元标志物的免疫细胞化学检测显示:诱导后5小时,NSE、NESTIN和GFAP的表达均呈阳性,提示四组细胞在诱导后均转化为神经元细胞。4.透射电镜下可见诱导后细胞,突起明显,胞核大,呈圆形或椭圆形,居于胞体中心,核染色浅,以常染色质为主,核仁明显,细胞质内细胞器丰富,核周可见大量的粗面内质网和夹杂其间的核糖体及线粒体。5. westernblot方法检测细胞诱导前后神经元特异表型蛋白的表达:与A组对照相比,B组和C组均呈现NSE、NESTIN蛋白的表达增强。(P<0.05).6.实时荧光PCR结果显示:三组细胞均表达Notch1、jagged1、Hes1、Hes5。三组细胞Notch1、Jagged1、Hes1、Hes5在诱导分化前后的表达有差异,差异具有统计学意义。结论:1.全骨髓贴壁和密度梯度离心法可以获得较高活力的MSCs,传代及换液法可以使MSCs得到纯化并成功建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞培养增殖体系。2.经形态学、超微结构及神经元细胞特异性表型蛋白的鉴定,在本实验培养诱导条件下,MSCs可体外诱导分化为神经元细胞。3.在MSCs诱导分化为神经元细胞的过程中,伴随着Notch信号通路相关基因的调节改变,提示Notch信号通路可能参与了MSCs向神经元方向的诱导分化。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-9
英文缩写  9-10
研究论文骨髓间充质干细胞向神经元方向的诱导分化及其机制的实验研究  10-40
  前言  10-13
  材料与方法  13-24
  结果  24-29
  讨论  29-35
  结论  35
  不足与展望  35-36
  参考文献  36-40
附图  40-50
综述骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化及其对脊髓损伤治疗的研究进展  50-62
  参考文献  58-62
致谢  62-63
个人简历  63

骨髓间充质干细胞向神经元方向诱导分化及其机制的实验研究

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