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炭疽杆菌毒力大质粒的驱除及比较蛋白质组学研究

作　者: 王华贵
导　师: 廖祥儒
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 质粒不相容性起始复制区 pXO1质粒 pXO2质粒蛋白质组学炭疽杆菌
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

炭疽芽孢杆菌引发的炭疽病是一种烈性的人畜共患的传染病,危害性极强。尤其近些年,国际上一些恐怖分子利用炭菌杆菌的芽孢制造的恐怖事件,严重干扰了人们的日常生活及社会经济秩序。因此,对其进行研究具有一定的理论价值和潜在的社会效益。在本研究中,运用质粒不相容性原理,分别以炭疽杆菌A16R与A16作为实验的出发菌株,构建了pXO1质粒缺失突变株A16RPI1和pXO2质粒缺失突变株A16PI2。对菌株A16RPI1与A16RP及A16PI2与A16R在生长趋势、糖代谢等方面进行了比较,并鉴定了A16PI2的荚膜生成能力；分别制备了A16RPI1与A16RP的23 h的全菌蛋白质样品和A16PI2与A16R的20 h的全菌蛋白质样品,通过pH 4-7梯度的双向电泳找出差异蛋白,并对差异蛋白点进行了质谱检测分析。得到了以下主要结果：1)菌株A16RPI1与菌株A16RP的生长趋势基本一致,且二者的糖代谢也无区别。2)菌株A16PI2与菌株A16R的生长趋势也是一致的,但二者的糖代谢情况稍有不同,A16PI2可以代谢果糖但是A16R却不能代谢果糖。经过荚膜培养实验验证,A16PI2确实不能生成荚膜。3)菌株A16RPI1与菌株A16RP稳定期蛋白质在pH 4-7这一梯度有5个差异蛋白,这些蛋白都定位在细胞质中,主要是翻译过程中的延伸因子和与氨基酸代谢相关的酶。4)菌株A16PI2与菌株A16R稳定期蛋白质在pH 4-7这一梯度有22个差异蛋白,这些蛋白基本都定位在细胞质中,只有一个功能未知的蛋白定位在细胞膜上,它们在功能上主要与翻译过程、转录调节、氨基酸的转运和代谢及芽孢的生成相关。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-11
  1.1 炭疽芽孢杆菌的形态与培养特性  7
  1.2 炭疽芽孢杆菌的危害  7-8
  1.3 炭疽芽孢杆菌的两个毒力大质粒及其毒力因子  8
  1.4 炭疽疫苗  8
  1.5 炭疽芽孢杆菌的毒力大质粒缺失株  8-9
  1.6 质粒不相容性及其应用  9
  1.7 研究的目的、意义和研究内容  9-11
第二章材料和方法  11-23
  2.1 实验仪器设备与主要试剂  11-12
    2.1.1 实验所用主要仪器  11
    2.1.2 实验所用主要试剂  11-12
  2.2 培养基及相关试剂配制  12-13
    2.2.1 培养基及抗生素的配制  12
    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳所用试剂的配制  12
    2.2.3 双向电泳中所用的溶液的配制  12-13
    2.2.4 胶内酶切所用的溶液的配制  13
  2.3 质粒、菌株和培养条件  13-14
  2.4 A16RPI1和A16PI2质粒缺失突变株的构建  14-19
    2.4.1 引物合成与DNA测序  14
    2.4.2 感受态的制备  14-15
    2.4.3 外源不相容重组质粒的构建  15-18
    2.4.4 质粒缺失突变株的筛选  18-19
  2.5 质粒缺失突变株和相应对比株的生理生化特征的比较  19-20
    2.5.1 质粒缺失突变株与相应对比株的生长曲线的测定  19
    2.5.2 质粒缺失突变株与相应对比株的生理生化特性的测定  19
    2.5.3 野生株A16与pXO2质粒缺失突变株荚膜生成能力的测定  19-20
  2.6 突变体和对比株的比较蛋白质组学的研究  20-23
    2.6.1 炭疽杆菌A16RP,A16RPI1,A16R,A16PI2全菌蛋白的样品制备  20
    2.6.2 双向电泳  20-21
    2.6.3 扫描与分析  21
    2.6.4 胶内酶切  21-22
    2.6.5 酶解肽段混合物的MALDI-TOF/TOF-MS质谱检测  22
    2.6.6 数据库查询  22-23
第三章结果与讨论  23-39
  3.1 pXO1缺失突变体A16RPI1和pXO2缺失突变体A16PI2的构建  23-30
    3.1.1 oriⅠ,oriⅡ,oriⅢ,oriⅣ;S4,S5,S11基因片段的扩增  23-24
    3.1.2 外源重组质粒的构建  24-25
    3.1.3 驱除目标质粒pXO1和pXO2  25-29
    3.1.4 驱除外源重组质粒  29-30
  3.2 A16RPI1与A16RP、A16PI2与A16R生长趋势的测定  30
  3.3 菌株A16RPI1与A16RP、A16PI2与A16R生理生化特性的比较  30-32
  3.4 A16PI2与A16荚膜生成能力的比较  32
  3.5 菌株A16RPI1与A16RP、A16PI2与A16的比较蛋白质组学  32-39
    3.5.1 A16RPI1与A16RP、A16PI2与A16稳定期全菌蛋白pH4-7的双向电泳图  32-34
    3.5.2 差异蛋白质谱数据的查询结果  34
    3.5.3 差异蛋白质的鉴定及分析  34-39
第四章结论与展望  39-40
  4.1 结论  39
  4.2 展望  39-40
致谢  40-41
参考文献  41-44
附录1:实验中所用引物  44-47
附录2:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  47

炭疽杆菌毒力大质粒的驱除及比较蛋白质组学研究

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