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色氨酸酶基因工程菌的构建与表达

作　者: 林陈水
导　师: 张建国
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 色氨酸酶基因克隆表达大肠杆菌K-12 L-色氨酸酶法生产代谢产物抑制 L-半胱氨酸吲哚丙酮酸
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

用PCR方法从大肠杆菌K-12中得到色氨酸酶操纵子DNA片段，该片段除带有完整的色氨酸酶基因外，还带有负责表达的启动子和调节基因，将这个DNA片段克隆到T载体上，经过测序发现其核苷酸序列与文献报道的完全一致。将含有色氨酸酶操纵子DNA的T载体的菌株在含有色氨酸的M9培养基中37℃培养能表达大量的目标蛋白，与空宿主相比其酶活只有略微的提高。为了证明质粒上的基因能表达出有活性的色氨酸酶，将这个DNA片段克隆到PET28c质粒的BamHI和HindⅢ位点上，使该片段受T7 RNA聚合酶的启动子控制，然后转化噬菌体DE3的溶源菌BL21(DE3)。用IPTG诱导表达T7RNA聚合酶，以表达质粒上的目的基因。在葡萄糖存在的条件下，用常规方法发酵和诱导(37℃／1mM IPTG)，发现表达的蛋白质条带的分子量与理论上计算的分子量一致。但是发酵液中检测不到吲哚，表明虽然表达了目标蛋白，但表达的蛋白质没有酶活性。在葡萄糖存在的条件下由于分解代谢产物阻遏，基因组上的色氨酸酶基因不表达，加入IPTG只表达质粒上的基因，如果在合适条件下测得色氨酸酶活性，则可以证明质粒上的基因能表达出有活性的色氨酸酶。检测发酵液中有无吲哚的形成，是定性检测酶活的最简单的办法。摸索发酵条件，如改变培养温度和IPTG浓度等，发现在30℃培养条件下，0.2mM IPTG诱导时，发酵液中的吲哚含量最高，表明低浓度的诱导剂或低温诱导有利于表达出有活性的色氨酸酶。在该条件培养得到的菌体能将吲哚、丙酮酸和氯化铵在pH9的条件下转变为色氨酸。总之，根据测序、表达的分子量和酶活性可以证明克隆到的DNA片段确实含有色氨酸酶基因。上述构建的质粒，含有两个启动子。可以分别用IPTG和色氨酸诱导表达色氨酸酶基因，本论文分别对两种诱导方法进行了发酵条件优化。用IPTG诱导表达实验结果表明：利用T7启动子在胞内能表达出有活性的酶；IPTG与温度的合适组合可以得到较高活性的色氨酸酶，在0.2mM以下浓度的IPTG诱导时，37℃是最适温度，而用较高浓度的IPTG诱导，低温是表达有活性的色氨酸酶的必要条件，而且诱导时间要短。0.2mM IPTG对菌体的生长有抑制作用，在细胞对数生长期前期诱导抑制最强烈，0.1mM IPTG基本不抑制生长；临界浓度0.15mM的IPTG和 37aC是比较好的组合。钙离子能提高酶活10％以上。在葡萄糖存在的条件下，用 IPTG诱导的酶活是不用IPTG诱导的91倍。用色氨酸诱导时添加易利用的碳源，菌体密度显著提高，总酶活反而降低：诱导剂色氨酸是最佳碳源，酵母膏和硝酸铰分别是最适有机和无机氮源。镁离子能显著提高酶活，0．01％的泡敌不影响酶活。另外，还考察了利用不同宿主表达色氨酸酶的情况，发现BL21（DE3）是最佳宿主。也比较了T载体和pET28C两种载体对生产色氨酸酶的影响。工程菌 BL21①E3）／pET28c1naA的活性是宿主菌 BL21rpE3）的 2．1倍。用色氨酸诱导得到的菌体比活较用IPTG诱导的高。然后在10LB．Braun发酵罐上观察了工程菌的发酵过程曲线，底物梢耗以及酶活曲线。并利用所得的菌体做色氨酸合成实验，分别以吼跺和L－半脐氨酸、叼跺和丙酮酸以及铰盐作为底物分别合成色氨酸，产物浓度分别达到Zgh4．Zgh。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-7
第一章文献综述  7-19
第二章色氨酸酶基因的克隆与鉴定  19-42
  2．1 前言  19-26
  2．2 材料与方法  26-29
    2．2．1 菌种  26
    2．2．2 仪器与DNA分析软件  26-27
    2．2．3 试剂与培养基  27
    2．2．4 质粒抽提  27-28
    2．2．5 连接与转化  28
    2．2．6 感受态细胞的制备  28
    2．2．7 SDS-PAGE  28-29
    2．2．8 甘油冷冻法简易保存菌种  29
  2．3 目的基因的克隆  29-34
    2．3．1 引物设计  29
    2．3．2 细菌基因组DNA的抽提  29
    2．3．3 用PCR技术扩增目的基因  29-31
    2．3．4 用T载体连接、转化JM109  31-32
    2．3．5 讨论  32-34
  2．4 目的基因的鉴定  34-42
    2．4．1 测序  34
    2．4．2 表达实验，SDS-PAGE初略测定目标蛋白的分子量  34-35
    2．4．3 消除本底的酶活性、单独表达外源导入基因  35-39
      2．4．3．1 将目的基因克隆到pET系统的载体  35-38
      2．4．3．2 表达实验  38-39
      2．4．3．3 初步摸索发酵条件，表达有活性的酶  39
    2．4．4 利用含外源基因表达的色氨酸酶的菌体合成色氨酸  39-40
    2．4．5 结论  40
    2．4．6 讨论  40-42
第三章发酵条件的优化  42-71
  3．1 材料与方法  42-45
    3．1．1 菌种与质粒  42
    3．1．2 仪器与设备  42
    3．1．3 吲哚的定量测定  42-44
    3．1．4 色氨酸的定量测定  44-45
    3．1．5 利用菌体中色氨酸酶合成L-色氨酸  45
  3．2 用IPTG诱导表达有活性的色氨酸酶  45-59
    3．2．1 IPTG浓度对色氨酸酶的表达的影响  45-48
    3．2．2 添加不同pH缓冲液对色氨酸酶表达的影响  48-50
    3．2．3 底物与辅酶对色氨酸酶表达的影响  50-51
    3．2．4 L-Arg对色氨酸酶表达的影响  51
    3．2．5 磷酸盐浓度对色氨酸酶表达的影响  51-52
    3．2．6 金属离子对色氨酸酶表达的影响  52
    3．2．7 葡萄糖浓度对色氨酸酶表达的影响  52-53
    3．2．8 发酵液装量对色氨酸酶表达的影响  53-54
    3．2．9 诱导时机与时间的选择  54-57
    3．2．10 诱导温度对色氨酸酶的表达的影响  57-58
    3．2．11 总结  58-59
  3．3 用色氨酸诱导表达色氨酸酶  59-71
    3．3．1 温度对色氨酸酶生产的影响  59-60
    3．3．2 碳源对色氨酸酶生产的影响  60-61
    3．3．3 氮源对色氨酸酶生产的影响  61-63
    3．3．4 金属离子对色氨酸酶生产的影响  63
    3．3．5 磷酸盐对色氨酸酶生产的影响  63-64
    3．3．6 维生素对色氨酸酶生产的影响  64-65
    3．3．7 初始pH对色氨酸酶生产的影响  65
    3．3．8 正交试验  65-66
    3．3．9 不同宿主对色氨酸酶活性的影响  66-67
    3．3．10 不同载体对色氨酸酶活性的影响  67
    3．3．11 发酵过程曲线  67
    3．3．12 总结  67-69
    3．3．13 两种诱导方法的比较  69-70
    3．3．14 利用菌体中色氨酸酶合成L—色氨酸  70-71
第四章结论与展望  71-74
参考文献  74-76
致谢  76

色氨酸酶基因工程菌的构建与表达

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