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紫外线白内障大鼠模型建立及二硫苏糖醇的疗效评估

作　者: 崔蓓
导　师: 柳林
学　校: 第二军医大学
专　业: 眼科学
关键词: 紫外线 DTT 大鼠白内障
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

白内障目前是世界上影响人类健康的常见病,是我国的第一位致盲疾病,发病机制尚不十分清楚,它的发生与多种因素有关,是多种因素综合作用的结果,比如晶状体蛋白基因突变、氧化损伤、辐射、老化、葡萄糖、半乳糖等代谢障碍、脂质过氧化物损伤等,发病的关键环节是晶状体发生混浊,影响光线经过晶状体的透射和折射,从而造成视物不清。紫外线(ultraviolet, UV)是波长为100～400nm的电磁波。它又分为:近紫外线UV-A(315～380nm)、远紫外线UV-B(290nm～315nm)和超短紫外线UV-C(<290nm)三部分。紫外线引起白内障的现象已在许多流行病学调查和实验研究中得到证实。研究表明,紫外线对晶状体上皮细胞的损伤作用随波长不同而不同,UV-A不能直接引起DNA的损伤,而UV-B作用较强。长期遭受慢性紫外线辐射,亦被认为是老年性白内障形成的重要因素。高原地区,尤其海拔最高的西藏高原由于空气稀薄,对来自太阳的紫外线的滤过作用弱,所受紫外线照射强度约为内地的2.5倍;许多高原地区常年积雪,这也是反射紫外线的最强物质,雪域高原的强紫外线照射与强反射共同作用,使高原地区人群眼病发病率明显高于内地。资料表明老年性白内障发病率与海拔的增高成正比,如西藏地区白内障的发病率与种族无关,而与海拔有关;日本对紫外线白内障研究表明:UV-B引起晶状体皮质及核混浊,相对年轻女性晶状体核混浊比皮质混浊显著。但有研究显示皮质及后囊下白内障与紫外线辐射量有关,核性白内障与其无关。众所周知,臭氧层是UV-B辐射的主要屏障,由于臭氧层的减少和紫外线辐射的增加,导致白内障更高的发病率。资料显示臭氧层减少1%的厚度,白内障的发生率将增加0.7%±0.1%;美国一项研究表明臭氧层减少1%的厚度,白内障的发生率将增加7%～10%,到2050年随着5～20%臭氧层的破坏,美国出现皮质性白内障患者将增加到16.7～83万例。紫外线对晶状体的影响是长期、慢性蓄积的氧化损伤过程。本课题组前期研究成果表明二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)具有良好的抗晶状体蛋白变性的作用,DTT是化学还原剂,可解开蛋白分子内及蛋白分子间的二硫键,并作为巯基保护剂,能抑制晶状体蛋白的热变性及非特异性聚集及热变性。前期研究已证明该药物在第8天用药后使硒性核性白内障核区斑块明显小于对照组。既然前期试验结果表明DTT硒性白内障晶状体混浊有明显的抑制作用,那么对于紫外线引起的白内障是否也有效果呢,本实验将对DTT对紫外线白内障的疗效做初步评价,并对紫外线白内障的发病机理进行探讨。这些研究的基础需要建立紫外线白内障的动物模型,基于此,需要建立快速、稳定的紫外线白内障大鼠模型。目前常用的构建紫外线白内障模型的方法主要是采用豚鼠,且造模周期长,不适合快速造模、观察晶状体混浊变化以及筛选干预药物所需。本文改良紫外诱导SD大鼠造模方法,应对快速造模需要。国外关于紫外线白内障造模的研究较多,但多为探讨辐射对指标造模结果的影响而非加快造模方法。因此本课题将细致研究紫外线白内障模型的建立,探索造模优化条件,尽量缩短造模时间,为后续研究提供便利,并以此为基础,进一步研究课题组前期药物DTT对紫外线白内障的疗效。研究目的:探讨紫外线辐射致SD大鼠白内障的实验方法,优化实验条件,初步研究紫外线致白内障的机理及自行配制的二硫苏糖醇(DTT)滴眼液对于SD大鼠紫外线白内障的抑制作用。主要方法:1.紫外线白内障大鼠模型的建立SD大鼠,6W龄,置于300nmUVB辐射,每天用裂隙灯显微镜观察大鼠晶状体的形态变化,对照紫外线白内障分级标准进行分级。至造模成功白内障形成后,取出晶状体离体培养,用暗视野电子显微镜观察晶状体的结果,经过处理后用透射及扫描电子显微镜观察晶状体的超微结构。2.紫外线致白内障机理研究剥离造模成功的大鼠眼晶状体和空白对照组大鼠眼晶状体,用过氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)试剂盒测定两组鼠眼晶状体中SOD和GSH含量,并取血送检血清生化指标,可以反映出辐射紫外线和正常对照组中酶含量及血清离子的变化。3.DTT的疗效评估紫外辐射造模,SD大鼠左眼均作为实验用药组,滴用我室自制的二硫苏糖醇(DTT)眼液;同鼠右眼作对照。在造模过程中,左眼每天滴用DTT眼液4次,每次1滴,实验过程中保持用药。右眼仅辐射紫外线但不用药。定期观察大鼠双眼白内障的发生发展过程,至紫外线白内障模型建立成功后,裂隙灯观察对比双眼晶状体的形态变化,而后取出晶状体做免疫组化,经过处理后用扫描电子显微镜观察晶状体的超微结果,并测定两组晶状体中SOD、GSH含量进行对比。实验结果:1.将出生后6W的雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.7ml,置于300nm紫外线灯下辐射15min,(双星明眼液和新福林眼液扩瞳后,每日辐射双眼一次),辐照度1×103uw/cm2,2天后即有少数大鼠发生轻度晶状体混浊,7天后可成功制作紫外线白内障动物模型,绝大多数白内障为皮质性白内障。2.辐射紫外线致白内障组鼠眼晶状体中SOD、GSH含量明显比空白对照组低;血清生化指标Ca2+、Na+高于空白对照组,K、P、Mg2+低于空白对照组。3.紫外线辐射2天实验大鼠右眼即可发生轻度晶状体混浊,7天造模成功,右眼几乎100%发生皮质性白内障,可以观察到晶状体体积增大,皮质明显混浊,少数核轻度混浊,相对清澈。左眼DTT药物组白内障皮质混浊程度明显比右眼对照组减轻,参考文献分级标准,右眼对照组均在2级左右,右眼大都3级,少数达到4级。结论:1.300nmUVB每天照射SD大鼠15min,连续7天,可成功制作紫外线白内障模型,多数为皮质性白内障。2.DTT对SD大鼠紫外线白内障具有良好的抑制作用。

紫外线白内障大鼠模型建立及二硫苏糖醇的疗效评估

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