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番茄花药和小孢子离体培养及转化雄性不育基因Barnase的研究

作　者: 吴志苹
导　师: 马兵钢；鲁晓燕
学　校: 石河子大学
专　业: 园艺学
关键词: 番茄 花药 小孢子 雄性不育 Barnase基因
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


番茄(Lycopersicon esculentum Mill)属于茄科番茄属,在世界各地广泛栽培,仅采用常规育种手段选育番茄新品种,进展缓慢,花药培养和游离小孢子培养技术可以获得纯系,有助于提高育种效率。同时,番茄是自花授粉作物,杂种优势十分明显,番茄雄性不育的研究对其杂交育种非常重要。本文对番茄花药培养与游离小孢子培养影响因素进行了研究,通过花药培养从‘里格尔87-5’、‘石番9号’、‘厚皮毛粉’中获得花粉植株；首次通过游离小孢子培养从‘里格尔87-5’、‘金冠’、‘钻石’和‘厚皮毛粉’获得了大量的球型胚、心型胚。同时,采用农杆菌介导法对烟草和番茄进行遗传转化,共获得25株转Barnase基因烟草和20株转Barnase基因番茄,并对转基因植株不育性生物学特征进行观察。具体结果如下：1.建立了番茄花药愈伤组织诱导及植株再生的实验体系。本研究以6个番茄品种的花药为材料,研究了番茄花药胚胎发生与植株再生。研究表明基因型是番茄花药培养影响的决定因素,不同基因型的愈伤组织诱导率明显不同；培养基中加入马铃薯汁、活性炭,6个品种的愈伤组织平均诱导率较对照分别降低了35.14%、95.48%；培养基中添加1.0m/L的2,4-D和0.5mg/L的KT,‘里格尔87-5’和‘石番9号’的诱导率都达最高；培养基中加入30g/L的蔗糖,‘里格尔87-5’的愈伤组织诱导率达20.24%；培养基中加入10μmol/L的硝酸银,花药组织褐化率较对照降低了70.59%。番茄花药愈伤组织在MS+ZT1.5mg/L+ IAA0.2mg/L培养基上,不定芽诱导率高达40%,此配方是番茄花药愈伤组织再分化成不定芽的较优配方；在不定芽分化的培养基中加入2mg/L的三十烷醇,可以提高不定芽的质量及其分化率,显著提高了有效芽百分比；当不定芽长至3-4cm大小时,接入1/2MS+2.0mg/LIBA进行诱导生根,获得了番茄花粉植株。2.番茄小孢子游离培养获得胚状体的研究。本实验采用两种不同方式的小孢子分离和培养系统,WM技术和SMC技术。结果表明,WM技术是番茄小孢子分离和培养的较优技术体系。SMC技术较WM技术相比,‘里格尔87-5’和‘金冠’的胚产量分别降低了53.56%、49.86%。不同基因型的胚胎发生能力差异很大。本实验的3个番茄品种在相同培养条件下,小孢子胚产量从高到低的依次为：‘里格尔87-5’、‘金冠’、‘钻石’、‘厚皮毛粉’、‘002’。其中,‘里格尔87-5’、‘金冠’和’钻石’较易形成胚状体,而在同一培养条件下,‘002’的胚产量仅有0.13个,不易产生胚状体。在番茄小孢子游离培养过程中,加入番茄的未成熟子房,5个品种的小孢子胚产量都明显高于对照。3.转化雄性不育Barnase基因烟草、番茄植株的获得。通过冻融法转化根癌农杆菌LB4404,获得转Barnase基因烟草和转Barnase基因番茄。转Barnase基因烟草和转Barnase基因番茄经卡那霉素筛选,PCR, RT-PCR检测,表明Barnase基因已整合到烟草和番茄基因组中,并且能在植物中正常转录和表达。花器形态结构观察发现,转Barnase基因烟草的花丝明显缩短,花药扁平,经压片检查没有正常的花粉粒。转Barnase基因烟草不能结实。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
主要英文缩略词表  10-12
引言  12-13
第一章 文献综述  13-21
  1. 番茄花药培养的研究现状  13-17
    1.1 外植体对番茄花药培养的影响  13-15
    1.2 预处理对番茄花药培养的影响  15
    1.3 培养基及其他附加物对番茄花药培养的影响  15-17
    1.4 培养条件对番茄花药培养的影响  17
  2 小孢子游离培养的研究概况  17-18
  3 核糖核酸酶与植物雄性不育关系的研究  18-19
  4. 存在的问题  19-20
  5. 本研究的目的和意义  20-21
第二章 番茄花药愈伤组织诱导及分化体系的建立  21-35
  1 引言  21
  2 材料与方法  21-24
    2.1 实验材料  21
    2.2 实验方法  21-24
  3 结果与分析  24-32
    3.1 番茄花蕾的外部形态与小孢子发育时期的对应关系  24-27
    3.2 番茄花药消毒方法的筛选  27
    3.3 植物生长调节剂对番茄花药愈伤组织诱导的影响  27-28
    3.4 不同蔗糖浓度对番茄花药愈伤组织诱导的影响  28-29
    3.5 不同硝酸银浓度对番茄花药褐化率及愈伤组织诱导的影响  29
    3.6 基因型和培养基对番茄花药愈伤组织诱导的影响  29-30
    3.7 番茄花药愈伤组织不定芽的诱导  30-31
    3.8 三十烷醇对番茄花药愈伤组织分化的影响  31-32
    3.9 植株的再生及移栽  32
  4 结论  32-33
  5 讨论  33-35
第三章 番茄小孢子离体培养研究  35-41
  1 引言  35
  2 材料与方法  35-37
    2.1 供试材料  35
    2.2 实验方法  35-37
  3 结果与分析  37-40
    3.1 小孢子离体发育过程的细胞学观察  37-38
    3.2 不同的小孢子分离及培养体系对胚状体诱导率的影响  38-39
    3.3 基因型对小孢子胚胎发生的影响  39
    3.4 未成熟子房对小孢子胚胎发生的影响  39-40
  4. 讨论  40-41
第四章 雄性不育基因Barnase转化烟草和番茄的研究  41-54
  1 引言  41
  2 材料与方法  41-46
    2.1 实验材料  41-42
    2.2 实验方法  42-46
  3 结果与分析  46-52
    3.1 质粒PCR鉴定结果  46-47
    3.2 番茄总RNA的提取  47
    3.3 烟草、番茄卡那霉素抗性芽及植株的再生  47-48
    3.4 抗性烟草、番茄的PCR检测  48-50
    3.5 烟草、番茄的RT-PCR检测结果  50
    3.6 转雄性不育Barnase基因烟草的育性鉴定与观察  50-52
  4 讨论  52-54
    4.1 农杆菌介导的番茄高效再生体系的建立  52
    4.2 雄性不育植株的筛选问题  52-53
    4.3 转基因番茄植株与非转基因番茄的根系形态分析  53-54
第五章 结论  54-55
  1. 通过番茄花药离体培养获得再生植株  54
  2. 通过番茄小孢子游离培养获得胚状体  54
  3. 转雄性不育Barnase基因烟草、番茄植株的获得  54
  4. 具有雄性不育特征的烟草的获得  54-55
参考文献  55-59
附录 主要生化试剂和转基因用试剂的来源和配制  59-62
附表  62-63
致谢  63-64
作者简历  64-65
导师评阅表  65

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 茄果类 > 番茄（西红柿）
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