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侵染百合的南芥菜花叶病毒的分子检测及鉴定

作　者: 刘毅
导　师: 陈丽梅
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 百合南芥菜花叶病毒巢式RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR
分类号: S436.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus ArMV)异名(Raspberry yellow dwarf virus, Rhabarber mosaic virus, Rhubarb mosaic virus),属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员,是我国二类检疫性植物病毒。百合是近年来发现的南芥菜花叶病毒的新寄主,并且病毒扩散呈上升趋势。因此建立敏感性高、特异性强,快速、安全和可靠的检测方法对于南芥菜花叶病毒的控制和出入境检验检疫至关重要。本研究利用分子生物学的方法,对来自于国外进口及云南省昆明市百合上的ArMV外壳蛋白基因片段进行了克隆测序和序列分析,同时建立了南芥菜花叶病毒的血清学ELISA、RT-PCR、巢式RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR核酸检测体系。对4种检测方法的灵敏度、特异性、安全性以及检测成本进行了比较,其主要内容和结果为：从对国外进口和昆明地区的百合不同品种ArMV的调查结果来看,ArMV侵染百合后,不显示症状。利用DAS-ELISA技术对百合植株不同部位病毒分布情况进行检测。从试验结果来看,病毒在种球、下部叶片和中部叶片上浓度最高,其次为顶部叶片、最低的是茎杆和花瓣。因此,春季是最佳检测病毒的时间,种球、下部叶片和中部叶片是最好的检测材料。此外,DAS-ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、成本较低且简便快速,有广泛应用价值。本文利用特异性引物建立了常规和巢式RT-PCR检测ArMV方法,扩增出了993bp和276bp特异性条带,这两种方法均能稳定、高效、快速地检测出ArMV的存在。通过特异性和敏感性试验显示：常规RT-PCR能对ArMV RNA进行10倍系列稀释后,在1.83×104个拷贝时检测到阳性样品,巢式RT-PCR则能在在0.91×103个拷贝时检测到阳性样品,说明巢式RT-PCR方法具有更高的敏感性。此外,巢式PCR具有更高的特异性。根据基因库中的ArMV高度保守序列,设计合成引物和TaqMan探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量PCR技术。对样品进行了特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,实时荧光TaqMan RT-PCR可检测到每个反应相当于1×102个拷贝数的病毒RNA,制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系,相关系数为0.993。与常规的RT-PCR和巢式RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点,能够对样品中微量ArMV进行准确检测,是一种检测ArMV的良好方法。综上所述,本研究成功克隆了ArMV的CP基因片段,并建立了ArMV的血清学ELISA、常规及巢式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测体系。这些检测体系的构建对于ArMV的预防控制有着重要的现实意义,为我国南芥菜花叶病毒的检测和植物检疫提供了坚实的技术支撑。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
插图和附表清单  10-12
第一章文献综述  12-33
  1.1 前言  12-14
  1.2 百合病毒病种类  14-15
  1.3 南芥菜花叶病毒  15-19
  1.4 植物病毒检疫的各种检测鉴定方法原理  19-32
  1.5 本论文的研究目的和意义  32-33
第二章材料与方法  33-49
  2.1 实验材料及试剂  33-36
  2.2 实验方法  36-49
第三章结果  49-67
  3.1 DAS-ELISA方法检测ArMV在百合病株上的分布  49-50
  3.2 南芥菜花叶病毒CP基因片段的克隆与鉴定  50-55
  3.3 RT-PCR方法检测南芥菜花叶病毒  55-56
  3.4 巢式RT-PCR方法检测南芥菜花叶病毒  56-59
  3.5 实时荧光定量TaqMan RT-PCR方法检测南芥菜花叶病毒  59-67
第四章讨论  67-71
  4.1 常规RT-PCR检测  67-68
  4.2 巢式RT-PCR检测  68
  4.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测  68-69
  4.4 DAS-EL1SA、常规及巢式RT-PCR和实时荧光定量TaqManRT-PCR 检测方法优缺点的比较  69-70
  4.5 总结  70-71
第五章结论和展望  71-73
  5.1 建立了南芥菜花叶病毒的DAS-ELISA检测方法  71
  5.2 建立了南芥菜花叶病毒RT-PCR检测方法  71
  5.3 建立了南芥菜花叶病毒的巢式RT-PCR检测方法  71
  5.4 建立了南芥菜花叶病毒的荧光定量TaqManRT-PCR检测方法  71-72
  5.5 研究展望  72-73
致谢  73-74
参考文献  74-80
附录A  80

侵染百合的南芥菜花叶病毒的分子检测及鉴定

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