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重要蔬菜种传检疫性病害检测技术研究

作　者: 阚春月
导　师: 衣杰荣；杨翠云
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 种传病害 黄瓜绿斑驳花叶病毒 烟草环斑病毒 黄瓜黑星病菌 检测方法
分类号: TS255.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本论文简单介绍了植物种传病害的定义、分类已及其相关检测技术的进展情况。真菌性种传病害的检测方法主要包括洗涤镜检、保湿培养、致病性测定和PCR等方法,植物病毒性病害的检测方法主要有症状观察（包括鉴别寄主反应）、血清学反应、分子生物学方法等。本论文以黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草环斑病毒和黄瓜黑星病菌为例,着重研究植物种传病毒病害和植物种传真菌病害的检测和研究方法,并对种传病害的检测方法作了简单总结。黄瓜绿斑驳病毒是典型的种传病毒,本研究以接种黄瓜绿斑驳病毒的带毒黄瓜种子作为材料,建立了快速检测黄瓜绿斑驳病毒的多种方法,包括DAS-ELISA法、普通RT-PCR法、荧光RT-PCR法、免疫捕获RT-PCR法和免疫磁珠RT-PCR法,并对各种检测方法的灵敏度进行了比较。结果表明,各种的PCR方法的灵敏度都比DAS-ELISA方法的灵敏度高,其中实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,可检测到2ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒。普通RT-PCR最低可检测到200ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒,而免疫捕获RT-PCR（IC-RT-PCR）的灵敏度是普通RT-PCR的2倍。免疫磁珠RT-PCR（IMS-RT- PCR）检测时,当磁珠包被的单克隆抗体浓度为1.5×10-5mg/ml时,可检测到的最低的抗原,浓度为7.813×10-3mg/ml,灵敏度是普通RT-PCR的4倍。烟草环斑病毒是豇豆花叶病毒科,可以通过种子进行传播,本研究通过设计TRSV外壳蛋白的特异性引物,利用实验室现有的TRSV毒源做为试验材料,建立了检测TRSV的普通RT-PCR方法、免疫捕获RT-PCR方法、实时荧光RT-PCR（SYBR Green法）的检测方法,并且对各种检测方法的灵敏度灵进行了研究,确定了不同方法所能检测到的病毒最低含量。黄瓜黑星病是重要的植物种传真菌病害,是近年来黄瓜生产中的重要病害之一,对我国黄瓜以及其他葫芦科蔬菜和果树生产的造成巨大损失。本研究以黄瓜黑星的三个菌株:菌株-11279、菌株-38730和菌株-沈阳作为实验材料,用PDA培养基进行真菌的培养,在20℃的黑暗和光照两种情况下进行孢子萌发条件的研究,结果表明,在黑暗条件下孢子易萌发。再将三个菌株接种于健康黄瓜叶片上,待黄瓜成熟后取出黄瓜种子,在进行一系列的PCR方法的研究。利用真菌通用引物ITS4/5进行初步筛选,再用特异性引物HGHX-F1/R以及W-F/R和N-F/R进行普通PCR和巢式PCR反应,得出特异性DNA扩增条带和DNA序列。将病菌的孢子形态与病菌的DNA序列结果相结合,从而鉴定出此三种植物真菌是黄瓜黑星病菌。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-22
第一章 黄瓜绿斑驳花叶病毒检测技术研究  22-36
  1.1 材料与方法  22-28
    1.1.1 材料  22-23
      1.1.1.1 毒源  22-23
      1.1.1.2 寄主植物  23
    1.1.2 仪器及试剂  23-24
      1.1.2.1 仪器  23
      1.1.2.2 试剂  23
      1.1.2.3 引物及探针设计  23-24
    1.1.3 方法  24-28
      1.1.3.1 病毒接种  24
      1.1.3.2 双抗体夹心-酶联免疫吸附法  24-25
      1.1.3.3 病毒RNA的提取  25-26
      1.1.3.4 RT-PCR方法及特异性  26
      1.1.3.5 实时荧光RT-PCR(Real-time RT-PCR)方法及其特异性  26
      1.1.3.6 免疫捕获RT-PCR  26
      1.1.3.7 免疫磁珠RT-PCR  26-27
      1.1.3.8 免疫磁珠包被抗体最适浓度的确定  27-28
      1.1.3.9 不同方法灵敏度试验  28
  1.2 结果  28-34
    1.2.1 生物接种得到发病种子  28-29
    1.2.2 RT-PCR方法及特异性  29
    1.2.3 实时荧光RT-PCR方法及特异性  29-30
    1.2.4 DAS-ELISA检测灵敏度  30-31
    1.2.5 RT-PCR检测灵敏度  31
    1.2.6 实时荧光RT-PCR检测灵敏度  31-32
    1.2.7 免疫捕获RT-PCR检测灵敏度  32-33
    1.2.8 免疫磁珠包被抗体浓度确定  33-34
    1.2.9 免疫磁珠RT-PCR的灵敏度  34
  1.3 结论与讨论  34-36
第二章 烟草环斑病毒的检测与研究  36-45
  2.1 材料与方法  36-39
    2.1.1 材料  36
    2.1.2 仪器及试剂  36-37
      2.1.2.1 仪器  36
      2.1.2.2 试剂  36
      2.1.2.3 引物设计  36-37
    2.1.3 试验方法  37-39
      2.1.3.1 病毒接种  37
      2.1.3.2 双抗体夹心-酶联免疫吸附法  37
      2.1.3.3 病毒RNA的提取  37
      2.1.3.4 RT-PCR方法及特异性  37-38
      2.1.3.5 SYBR Green PCR 检测方法  38
      2.1.3.6 免疫捕获RT-PCR  38-39
  2.2 结果  39-44
    2.2.1 生物接种获得发病种子  39-40
    2.2.2 RT-PCR和IC-RT-PCR方法及特异性  40-41
    2.2.3 SYBR Green PCR检测方法特异性  41
    2.2.4 DAS-ELISA检测灵敏度  41-42
    2.2.5 RT-PCR检测灵敏度  42-43
    2.2.6 SYBR Green PCR检测灵敏度  43
    2.2.7 免疫捕获RT-PCR的灵敏度  43-44
  2.3 结论与讨论  44-45
第三章 黄瓜黑星病菌检测方法研究  45-55
  3.1 材料与方法  45-48
    3.1.1 材料  45
      3.1.1.1 供试菌种  45
      3.1.1.2 培养基  45
    3.1.2 仪器及试剂  45-46
      3.1.2.1 仪器及器具  45
      3.1.2.2 试剂  45
      3.1.2.3 引物设计  45-46
    3.1.3 方法  46-48
      3.1.3.1 病菌培养  46
      3.1.3.2 显微镜观察  46
      3.1.3.3 病菌接种  46-47
      3.1.3.4 DNA提取  47
      3.1.3.5 PCR检测方法  47-48
  3.2 结果  48-53
    3.2.1 病原菌形态观察  48-50
    3.2.2 接种试验  50
    3.2.3 几对引物的PCR检测  50-51
    3.2.4 PCR引物特异性试验  51-53
      3.2.4.1 引物Cc-F/R-560和Cc-F/R-310特异性试验  51-52
      3.2.4.2 引物ITS4/5特异性试验  52
      3.2.4.3 巢式PCR引物Cc-W-F/R和Cc-N-F/R特异性试验  52-53
    3.2.5 Cc-F\R引物灵敏度试验  53
  3.3 结论与讨论  53-55
参考文献  55-60
附录  60-62
致谢  62

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 水果、蔬菜、坚果加工工业 > 果蔬加工品标准与检验
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