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极低频脉冲磁场对正常大鼠和体外培养皮质神经元的损伤效应

作　者: 董娟
导　师: 李伯勤
学　校: 山东大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 极低频脉冲电磁场大鼠学习记忆脑电描记术细胞培养大脑皮层神经元细胞内游离钙离子线粒体膜电位
分类号: R35
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究目的：随着科学技术的发展，社会的进步，电磁辐射在广播、通信、工业、科学研究、国防、医疗卫生等各个领域得到了广泛的应用，并深入到家庭中。然而，电磁辐射也成为继“三废”污染之后的第四大环境污染源，严重影响了人体健康。因此，各类电磁场的生物效应便成为生物电磁学领域的一个重要课题。在人体各系统中，中枢神经系统是对电磁辐射最敏感的系统，神经元是神经系统结构和功能的基本单位，要深入探讨脉冲磁场对神经系统的生物学作用，就必须开展脉冲磁场对神经元作用的研究。脉冲磁场对神经元的生物学效应是磁场和神经元共同作用的结果，是与两者的参数密切相连的。脉冲磁场的频率、强度、作用时间，接受磁场作用的神经元的来源、部位、生长状态等参数都是影响脉冲磁场生物学效应的主要因素。本课题对大鼠头部和体外培养胎鼠皮质神经元施加脉冲磁场辐射，旨在探讨极低频（15Hz）脉冲磁场对大鼠学习和记忆、脑组织形态学、脑电图的影响及对体外培养胎鼠皮质神经元的损伤效应，并综合分析其可能机制。研究方法：1．36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组（A组）和实验组（B组），对实验组大鼠施加脉冲磁场辐射（重复频率15Hz、平均场强0.1mT），发射源固定于清醒态大鼠颅顶骨外约2mm处，45min／次，1次／d，连续30d。辐射完毕12h后，分别对对照组和实验组大鼠进行以下检测：（1）．Morris水迷宫测试以检测大鼠学习记忆能力的变化，并用摄像机实时拍摄两组大鼠的行为。（2）．形态学观察：①．光学显微镜观察：将2组大鼠断头处死，在冰盒上快速开颅取脑，取额叶皮质脑组织，常规制备石蜡切片，苏木精—伊红（HE）染色，进行光镜观察。②．透射电子显微镜观察：将取得的额叶皮质脑组织修成约1mm³的小样品块若干，迅速置入3％戊二醛固定液中，常规方法制备超薄切片，JEM-1200EX透射电子显微镜观察记录。（3）．脑电图（EEG）检查：以检测两组大鼠脑电节律的变化。2．以Wistar孕大鼠15.5～16.5d的胚胎原代培养的大脑皮质神经元为实验材料。神经元培养48h后，随机分为对照组和实验组，对实验组神经元施加极低频脉冲磁场辐射，主要参数选择：重复频率15Hz、平均场强0.1mT，30min／次，3次／d，共2d。辐射完毕12h后，分别对对照组和实验组神经元进行以下检测：（1）．检测神经元的形态学变化：利用透射电子显微镜观察神经元超微结构的变化。（2）．相对存活率测定：四甲基偶氮噻唑蓝比色法（MTT）测定实验组神经元的相对存活率。（3）．流式细胞术测定神经元胞浆内游离Ca²⁺浓度的变化：收集细胞，加Fluo3／AM至终浓度为10μmol／L，避光孵育1h。利用流式细胞仪检测（激发波长为506nm，发射波长为526nm），取10000个神经元荧光强度值的平均值为各组测定值。（4）．流式细胞术测定线粒体膜电位：收集细胞，加罗丹明123至终浓度为10μg／ml，孵育30min。利用流式细胞仪检测（激发波长为488nm，发射波长为530nm），取10000个神经元荧光强度值的平均值为各组测定值。结果：1．极低频脉冲磁场对正常大鼠学习记忆、脑组织形态学及EEG的影响：（1）、两组大鼠在水迷宫中游泳的情况：对照组大鼠在水迷宫中游泳姿势协调、肌力、抖毛反射均正常。第一次辐射完毕24h后实验组大鼠精神萎靡，在水迷宫中游泳姿势不协调、肌力减退，抖毛反射减弱，但是，随着时间的推移，此现象逐渐消失。（2）、Morris水迷宫测试结果：对照组和实验组大鼠在实验1d、2d、3d、4d、5d、9d、20d、29d的逃避潜伏期分别为19.4±10.0、14.1±10.0、12.7±10.1、6.6±3.5、6.5±3.0、6.1±2.8、7.1±2.2、6.1±16.8和55.2±32.2、17.3±9.9、13.3+9.0、8.9±3.1、7.7±2.6、6.5±1.4、7.8±10.5、7.1±7.3。（3）．极低频脉冲磁场辐射对大鼠脑组织形态学的影响：①．光学显微镜观察：对照组大鼠皮质区神经元胞体饱满，轴突明显。实验组大鼠皮质区神经元胞体固缩，染色质边集。②．透射电子显微镜观察：对照组大鼠皮质神经元细胞核呈圆形，核仁居中，染色质的密度和分布正常，核周体胞质中细胞器丰富。实验组大鼠皮质神经元出现超微结构改变。（4）．脑电图检测结果：对照组大鼠脑电图的频率和波幅分别为9.67±1.37（Hz）和76.7±10.8（μm）；实验组大鼠脑电图的频率和波幅分别为7.71±1.12（Hz）和58.9±8.6（μm）。2．极低频脉冲磁场对体外培养胎鼠皮质神经元的损伤效应：（1）．形态学观察：对照组神经元，倒置显微镜下所见：分散均匀，胞体饱满立体感强，呈三角形或多角形，细胞之间建立突起联系，胞体及突起表面平滑。电镜下，神经元双层核膜清晰光滑，常染色质丰富，核周体胞浆中线粒体较多，其双层膜和嵴清晰。实验组神经元，倒置显微镜下所见：生长状态欠佳，胞体欠饱满，神经元之间也有突起联系，但较对照组明显减少，胞体和突起表面粗糙。电镜下，神经元胞浆内分布有较多的髓样体，大部分线粒体的嵴排列紊乱，局部或完全空化，可见数个空泡化的线粒体聚集并被单层膜包绕在一起（线粒体聚集现象）。（2）、相对存活率测定：对照组和实验组神经元光密度(A₅₇₀)值分别为0.494±0.031和0.401±0.023。（3）、神经元胞浆内游离Ca²⁺浓度的测定：对照组和实验组神经元胞浆内游离Ca²⁺平均荧光强度分别为66.69±2.24和78.22±1.59。（4）．线粒体膜电位测定：对照组和实验组神经元线粒体膜电位平均荧光强度分别为69.49±1.94和41.66±2.01。结论：本实验条件下，极低频脉冲磁场（重复频率15Hz、平均场强0.1mT）长时程（30d）辐射可影响大鼠的脑电节律，并可导致大鼠皮质神经元凋亡及其他超微结构改变；可抑制体外培养的胎鼠皮质神经元生长并可导致其代谢异常、胞浆内游离Ca²⁺浓度升高及线粒体膜电位降低。极低频脉冲磁场（重复频率15Hz、平均场强0.1mT）长时程辐射时，虽然只是在起初观察到实验组大鼠明显的运动感觉记忆障碍，之后逐渐恢复，但脑组织形态学检测和脑电图检查都存在显著异常改变，因此，探讨极低频脉冲磁场的生物学效应需要综合分析多项指标，并应充分考虑其长时程辐射带来的负面影响。意义：本课题选择清醒态相似频率（15Hz）作用于成年大鼠头部和体外培养的胎鼠皮质神经元，揭示了极低频脉冲磁场长时程辐射对大鼠学习记忆的负面影响及对离体和在体神经元的损伤效应及其可能机制，为进一步探讨极低频脉冲磁场对神经系统的生物学效应及其机制提供了实验资料，为临床合理利用极低频脉冲磁场提供参考。

全文目录

摘要  6-10
ABSTRACT  10-15
符号说明  15-16
文献综述  16-31
正文  31-67
  前言  31-32
  实验材料  32-38
    一.实验动物和体外培养的胎鼠皮质神经元  32
    二.主要仪器设备  32-33
    三.实验试剂及耗材  33-34
    四.主要溶液配制  34-38
  实验方法  38-45
    一.极低频脉冲磁场辐射  38
    二.Morris水迷宫测试  38
    三.行为记录  38
    四.形态学观察  38-41
    五.脑电图检查  41
    六.胎鼠大脑皮质神经元培养  41-42
    七.神经元鉴定  42
    八. 施加极低频脉冲磁场辐射  42
    九.形态学观察  42-43
    十.四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)检测  43
    十一.神经元胞浆内游离Ca~(2+)测定  43-44
    十二、线粒体膜电位测定  44-45
  结果  45-51
    一.极低频脉冲磁场辐射对大鼠行为的影响  45
    二.极低频脉冲磁场辐射对大鼠学习与记忆的影响  45
    三.极低频脉冲磁场辐射对大鼠脑组织形态学的影响  45-46
    四.极低频脉冲磁场辐射对大鼠脑电图的影响  46
    五.神经元鉴定结果  46
    六.极低频脉冲磁场辐射对神经元形态学的影响  46-48
    七.极低频脉冲磁场辐射对神经元相对存活率的影响  48-49
    八.极低频脉冲磁场辐射对神经元胞浆内游离Ca~(2+)浓度的影响  49-50
    九.极低频脉冲磁场辐射对神经元线粒体膜电位的影响  50-51
  讨论  51-57
  结论  57-58
  附图  58-64
  参考文献  64-67
致谢  67-68
攻读学位期间已发表和待发表的学术论文目录  68-69
学位论文评阅及答辩情况表  69

极低频脉冲磁场对正常大鼠和体外培养皮质神经元的损伤效应

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