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高产虾青素红法夫酵母的选育、发酵条件优化及代谢通量分析

作　者: 孙乃霞
导　师: 赵学明
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 红法夫酵母 虾青素 类胡萝卜素 诱变 发酵优化 代谢通量分析
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


虾青素是一种高附加值的酮式类胡萝卜素,具有极强的淬灭单线态氧和清除自由基的能力,在食品、医药等方面有广阔的应用前景。红法夫酵母天然可产虾青素,且具有发酵周期短,易于实现高密度培养等特点而受到广泛关注。目前的研究热点主要是高产菌株的筛选和发酵条件的优化。本论文以野生型红法夫酵母As2.1557作为出发菌株,经过两轮紫外线诱变和两轮亚硝基胍诱变,以10-4-10-3 mol/L的β-紫罗酮作为抗性筛选剂,最终选育出一株虾青素高产菌株UV-N2-7。在未优化条件下,此突变株虾青素的含量和产量分别为933.8μg/gDCW和1.614 mg/L,较出发菌株分别提高了2.3倍和82%,且遗传性能稳定。本论文利用单因素实验研究了突变株UV-N2-7的摇瓶发酵条件。分别考察了发酵培养基中不同的碳源、氮源、培养基的初始pH值、以及种龄、接种量、装液量(溶氧)、发酵温度等因素对红法夫酵母生长以及虾青素合成的影响。并根据单因素发酵实验的结果,采用统计学方法优化红法夫酵母合成虾青素的发酵过程。首先利用Plackett-Burman设计法考察了培养基组分和发酵条件中的10个因素对菌体生长和虾青素合成的影响,从中筛选出三个影响虾青素产量的关键因素:碳源浓度、初始pH值和发酵温度。随后采用最陡爬坡实验确定最大响应区域,最后利用响应面分析得到虾青素合成的最佳培养基组成和培养条件为:蔗糖31.7 g/L,氮源(牛肉膏:(NH4)2SO4=1:1) 5 g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,酵母抽提物0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L,CaCl2·2H2O 0.1 g/L,初始pH 5.05,种龄24 h,接种量5%,装液量40 mL/500 mL三角瓶,发酵温度17.8℃,在该最优条件下发酵,虾青素的产量可达到6.338 mg/L,含量为1242μg/gDCW。本文运用代谢通量分析的方法,分析和对比了分批发酵时出发菌株和突变株的代谢通量分布情况。结果表明:突变株PP途径的通量较野生株有所减小,但是EMP途径和TCA循环的途径的通量增大;突变株用于生物质合成的通量略有减小;二者丙酮酸脱氢酶的反应效率均较低,约有32%的丙酮酸分泌到胞外。因此丙酮酸是红法夫酵母代谢过程中的关键节点,预计通过遗传改造和发酵控制增大丙酮酸到乙酰辅酶A的通量应可能会进一步提高虾青素的产量。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 文献综述  8-24
  1.1 虾青素的理化性质、功能和用途  8-10
    1.1.1 虾青素的理化性质与结构  8-9
    1.1.2 虾青素的功能和用途  9-10
  1.2 全球虾青素市场的发展概况  10
  1.3 虾青素的生产方法和现状  10-12
    1.3.1 化学合成  11
    1.3.2 虾青素的化学提取  11
    1.3.3 微生物法  11-12
  1.4 红法夫酵母合成虾青素的研究进展  12-20
    1.4.1 红法夫酵母简介  12
    1.4.2 红法夫酵母中虾青素的合成路径  12-14
    1.4.3 高产虾青素红法夫酵母的选育  14-19
    1.4.4 生产工艺优化  19-20
  1.5 统计学方法在优化中的应用  20-21
    1.5.1 Plackett-Burman 实验设计  20-21
    1.5.2 最陡爬坡实验（Method of path steepest ascent）  21
    1.5.3 响应面方法（Response surface methodology, RSM）  21
  1.6 代谢通量分析  21-23
    1.6.1 代谢通量分析简介  21-22
    1.6.2 代谢通量分析的理论和方法  22-23
  1.7 本课题的主要研究内容  23-24
第二章 实验材料与方法  24-33
  2.1 实验材料  24-26
    2.1.1 菌种  24
    2.1.2 培养基  24-25
    2.1.3 实验仪器  25
    2.1.4 药品与试剂  25-26
  2.2 实验方法  26-33
    2.2.1 培养方法  26-27
    2.2.2 分析方法  27-29
    2.2.3 菌种选育  29-30
    2.2.4 培养基组分和培养条件的优化  30-32
    2.2.5 分批发酵代谢通量分析方法  32-33
第三章 结果与讨论  33-59
  3.1 出发菌株发酵曲线的测定  33-34
    3.1.1 出发菌株生长曲线的绘制  33
    3.1.2 虾青素标准曲线的绘制及红法夫酵母虾青素合成曲线  33-34
  3.2 高产菌株的选育  34-40
    3.2.1 诱变剂量与筛选剂浓度的确定  35-36
    3.2.2 诱变结果  36-39
    3.2.3 突变株的稳定性检验  39-40
  3.3 发酵培养基组分及培养条件对虾青素生物合成的影响  40-46
    3.3.1 碳源种类对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  40-41
    3.3.2 氮源种类对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  41-42
    3.3.3 初始pH 值对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  42-43
    3.3.4 种龄对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  43
    3.3.5 接种量对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  43-44
    3.3.6 装液量对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  44-45
    3.3.7 温度对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响  45-46
  3.4 发酵条件优化  46-53
    3.4.1 Plackett-Burman 实验设计法筛选重要因素  46-48
    3.4.2 最陡爬坡实验  48
    3.4.3 响应面法优化发酵条件  48-53
  3.5 红法夫酵母代谢网络的建立及代谢通量分析  53-59
    3.5.1 分批培养中红法夫酵母代谢网络的建立  53-54
    3.5.2 红法夫酵母生物质合成前体物需求系数的计算  54-55
    3.5.3 红法夫酵母代谢通量平衡模型的建立  55-56
    3.5.4 分批培养条件下红法夫酵母的代谢通量分析  56-59
第四章 结论  59-61
参考文献  61-68
发表论文和科研情况说明  68-69
致谢  69

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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