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阿卡波糖产生菌育种新方法的研究与应用

作　者: 马妮
导　师: 何建勇；白秀峰
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 阿卡波糖 α-葡萄糖苷酶抑制剂 菌种选育 原生质体诱变 固体发酵 理性化筛选模型
分类号: TQ464.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


α-葡萄糖苷酶抑制剂—阿卡波糖是治疗Ⅱ型糖尿病的一种新药，它通过与葡萄糖苷酶发生竞争性抑制作用从而达到降低餐后血糖的目的。因阿卡波糖的化学结构比较复杂，目前阿卡波糖工业规模的生产都是通过微生物发酵实现的。 本论文通过创立阿卡波糖产生菌的原生质体诱变技术、固体发酵技术和阿卡波糖含量快速测定技术，并把这些新技术结合应用，建立了高效的阿卡波糖产生菌诱变筛选方法。将该方法应用在阿卡波糖产生菌的诱变育种中，取得了非常显著的效果。 本论文首先对阿卡波糖产生菌-游动放线菌Actinoplanes sp．的原生质体制备条件和再生条件进行了考察。通过改进制备条件和再生条件使原生质体制备量达到8.0×107／mL左右，再生率达到8.0％左右，基本达到了原生质体诱变的要求。 然后，本论文对阿卡波糖的固体发酵条件进行了探索，建立了适合固体发酵阿卡波糖的工艺条件。在建立了固体发酵方法的基础上，本论文又创立了测定固体发酵后阿卡波糖含量的快速测定方法。将这些新的技术结合使用，本论文建立了高效的阿卡波糖产生菌诱变筛选方法，加快了筛选的速度，节约了筛选的成本。 本论文还考察了适于原生质体诱变的诱变剂种类和最佳诱变剂量；并建立了胺离子耐受及麦芽糖耐受的理性化筛选模型。 通过应用新的诱变筛选方法，筛选得到一株NH4+调节突变菌株AC-N1，其传代稳定，发酵单位达到3700μg／ml左右，约是原始出发菌株发酵单位的2.2倍。以AC-N1菌株为对象，通过正交设计实验初步优化了发酵培养基的组成，经摇瓶发酵，发酵单位达到4300μg／mL左右，约是原始出发菌株发酵单位的2.7倍。最后，通过摇瓶补料试验使单位又提高了22.4％，批产量提高了76.3％。

全文目录


中文摘要  9-10
英文摘要  10-12
第1章 前言  12-19
  1.1 阿卡波糖概述  12-14
  1.2 阿卡波糖生物合成途径及相关酶  14-17
  1.3 阿卡波糖的研究现状  17
  1.4 本论文研究内容  17-19
第2章 实验材料与方法  19-30
  2.1 实验材料  19-23
  2.2 实验方法  23-30
    2.2.1 阿卡波糖产生菌的菌种筛选  23-24
      2.2.1.1 超声波断裂菌丝体的方法  23
      2.2.1.2 原生质体制备  23-24
      2.2.1.3 诱变处理方法  24
      2.2.1.4 液体发酵的初、复筛  24
      2.2.1.5 菌种保藏方法  24
      2.2.1.6 计算方法  24
    2.2.2 阿卡波糖的测定  24-25
      (1)HPLC检测条件:  25
      (2)磷酸盐缓冲液配制:  25
      (3)阿卡波糖效价的测定:  25
      (4)样品的预处理  25
    2.2.3 发酵参数的测定  25-30
      2.2.3.1 菌浓的测定  25-26
      2.2.3.2 发酵液中糖含量的测定  26-28
      2.2.3.3 氨基氮的测定  28-30
第3章 实验结果与讨论  30-58
  第一部分 高效筛选方法的建立  30-44
    3.1 阿卡波糖含量快速测定方法的建立  30-32
      3.1.1 原理  30
      3.1.2 试验过程与结果  30-32
    3.2 菌株纯化方法的探索  32-42
      3.2.1 超声波断裂菌丝的方法  32
      3.2.2 制备原生质体  32-42
        3.2.2.1 一级培养时间和液体培养基的考察  32-34
        3.2.2.2 二级培养条件的考察  34-38
        3.2.2.3 酶浓度和酶解时间的考察  38-39
        3.2.2.4 再生培养基的考察  39-42
    3.3 固体琼脂块筛选法的建立  42-44
  第二部分 高产菌株的筛选  44-58
    3.4 自然选育  44-46
      3.4.1 出发菌株的形态特征  44
      3.4.2 自然选育的过程及结果  44-46
    3.5 诱变育种  46-53
      3.5.1 出发菌株的准备  46-47
      3.5.2 诱变剂处理  47-48
      3.5.3 突变株的筛选  48-51
      3.5.4 高产突变株的选育谱系  51-52
      3.5.5 高产突变株稳定性的考察  52-53
    3.6 高产菌株发酵工艺的初步优化  53-56
      3.6.1 发酵培养基的考察  53-54
      3.6.2 补料试验  54-56
    3.7 高产突变株发酵代谢曲线的绘制  56-58
第4章 结论  58-59
参考文献  59-61
致谢  61

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产 > 酶及辅酶
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