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长期施肥对水稻土亚硝酸还原酶基因（nirK、nirS）多样性的影响

作　者: 罗希茜
导　师: 胡荣桂；魏文学
学　校: 华中农业大学
专　业: 环境科学
关键词: 长期施肥 水稻土 反硝化 nirK nirS 多样性
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


反硝化作用是造成土壤氮素损失的主要途径之一,不仅导致氮肥利用率降低,同时增加温室气体N2O的排放量,破坏大气臭氧层,加速全球气候变暖,对环境产生严重影响。长期施肥对稻田土壤反硝化作用有重要影响,化肥尤其是氮肥的大量投入,促进了反硝化作用,提高了N2O的排放量。以反硝化过程中的关键功能基因——亚硝酸还原酶编码基因（nirK、nirS）为分子标记,探讨施肥对反硝化菌群落多样性的影响,有助于提高稻田系统氮素利用率,减少温室气体排放和环境污染,为稻田生产力可持续性发展提供重要理论依据。本研究利用中国科学院桃源农业生态试验站始于1990年的长期施肥试验,选取不施肥（CK）、施氮肥（N）、平衡施化肥（NPK）、有机肥配施化肥（NPKOM）四种不同施肥处理的土壤样品,利用分子生物学技术,研究了不同施肥处理对水稻土亚硝酸还原酶基因nirK、nirS多样性的影响。研究通过设计简并引物,采用降落式PCR扩增目的基因。目的片段用pGEM-T载体连接,转化至大肠杆菌DH-5α中,通过蓝白斑筛选克隆进行测序。根据测序结果,构建nirK、nirS基因克隆文库,计算多样性指数、绘制Chaol预测曲线,进行LIBSHUFF分析及系统发育分析。主要结果如下:1)长期不同施肥对土壤反硝化速率产生了不同影响,NPKOM处理的反硝化速率显著高于其他三个处理,N处理次之。NPK处理的反硝化速率高于CK处理,但没有显著差异。2)根据Chaol预测分析,长期不同施肥对nir基因多样性的影响不一致。NPK处理比N和NPKOM处理更有利于提高含,nirK基因反硝化菌群落的多样性,而N处理使nirS基因的多样性显著提高。3)利用LIBSHUFF方法分析不同施肥的基因文库差异,发现nirK基因四个处理间两两比较的差异都达到显著水平,而nirS基因的处理间则无显著差异。表明长期施肥明显改变了含nirK基因的反硝化菌的群落结构,对nirS基因群落结构影响较小。4)本研究克隆的249个nirK基因序列有232个与NCBI数据库中已知nirK基因片段相似,nirS基因克隆只有79%与已知序列相似。nirK基因序列与数据库中未知菌种的nirK基因相似性较高,为80%～95%,平均达90.7%;而nirS基因片段与数据库中已知的nirS基因相似度低,为72%～82%,平均为74.7%。因此无法判断本研究克隆得到的nirK、nirS基因片段所属的菌种。系统发育分析结果显示,nirK基因的OTUs可分为8个大簇,且不同处理下的OTUs有聚集情况,表明施肥改变了nirK反硝化菌群落中优势种的分布。大多数nirS基因克隆聚集在一个主要的大簇中,不同处理的OTUs分布则较平均,无明显的聚集情况,显示其群落的稳定性。总体来说,长期不同施肥对水稻土nirK、nirS基因反硝化菌群落多样性的影响不一致,平衡施化肥明显提高nirK基因多样性,单施氮肥使nirS基因多样性达到最高,其他施肥处理对nir基因多样性的影响不显著。施肥明显改变了nirK基因群落的结构组成,但对nirS基因群落结构无显著影响;nirK基因群落结构对施肥处理的敏感度大于nirS基因。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语简介  10-11
1 前言  11-21
  1.1 N_2O的温室效应及其排放源  11-12
  1.2 施肥对农田N_2O排放的影响  12-14
  1.3 反硝化作用分子机理简介  14-16
  1.4 土壤微生物多样性的研究方法  16-18
  1.5 反硝化基因的研究现状  18-19
  1.6 研究目的与内容  19
  1.7 技术路线  19-21
2 材料与方法  21-32
  2.1 试验样地  21
  2.2 样品的采集与预处理  21-22
  2.3 土壤理化性质及反硝化速率测定  22
  2.4 土壤微生物总DNA提取  22-23
    2.4.1 土壤DNA提取所需试剂  22-23
    2.4.2 提取步骤  23
  2.5 简并引物设计  23-25
  2.6 nir基因片段的PCR扩增  25-26
  2.7 克隆测序  26-29
    2.7.1 PCR产物纯化  26-27
    2.7.2 连接反应  27
    2.7.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  27-28
    2.7.4 转化反应  28-29
    2.7.5 筛选克隆测序  29
  2.8 序列分析  29-31
    2.8.1 多样性指数计算  29-30
    2.8.2 基因文库库容计算  30
    2.8.3 Chaol预测分析  30
    2.8.4 基因文库LIBSHUFF分析  30-31
    2.8.5 系统发育分析  31
  2.9 核苷酸序列登录号  31-32
3 结果分析  32-46
  3.1 土壤基本理化性质及反硝化速率  32-33
  3.2 DNA提取与nir基因片段的扩增  33-36
    3.2.1 土壤微生物总DNA的提取  33-34
    3.2.2 PCR扩增目的片段  34-36
  3.3 序列分析  36-46
    3.3.1 序列片段克隆测序分析  36-37
    3.3.2 多样性指数分析  37-38
    3.3.3 库容及Chaol预测分析  38-40
    3.3.4 LIBSHUFF分析  40-41
    3.3.5 系统发育分析  41-46
4 讨论  46-50
  4.1 简并引物的设计  46-47
  4.2 施肥对反硝化菌群落的影响  47-48
  4.3 nirK与nirS的差异  48-50
5 结论与研究前景  50-52
  5.1 结论  50
  5.2 研究前景  50-52
参考文献  52-62
致谢  62-63
硕士阶段发表论文  63

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境植物学
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