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不同神经网络活动水平下突触结构可塑性与P150~(Glued)G59S突变体相关的神经退行性疾病机制的研究

作　者: 王天予
导　师: 毕国强
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 神经生物学
关键词: 神经网络突触结构可塑性发育阶段活动依赖可塑性 P150Glued FBXL5 G59S
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

神经系统可以通过自身活动调节神经突触效能、影响突触发育以及维持突触联系。细胞骨架蛋白Actin在大脑中兴奋性神经元树突棘部位的含量非常丰富。神经活动同样可以调节Actin在突触后的含量。在神经网络的发育过程中,随着突触后终末传递效能的提高,Actin在树突棘的聚合逐渐增加。然而,在发育过程中神经网络活动对于Actin以及突触结构的调节规律与机制仍不清楚。为了回答这个问题,我们设计实验分别在发育中的和相对成熟的体外培养的胎鼠海马神经元网络中用Tetrodotoxin （TTX）长时程阻断所有动作电位的产生。我们发现在有TTX长时程抑制发育中神经网络活动的实验组中,突触的密度以及Actin在树突棘的表达量都有显著的增加。然而,在TTX长时程作用的成熟神经元网络中却没有观察到类似现象,表明神经元活动在发育的不同阶段中对于突触结构可塑性的调节起到不同的作用。在转染了CaMKII的神经元网络中,有TTX长时间抑制的发育中神经网络实验组突触密度无明显变化,但CaMKII在树突棘的表达量有显著的增加。同样,在TTX长时间存在的成熟神经元网络中突触的密度无明显变化并且CaMKII在树突棘的表达量也无显著的增加。CaMKII的过表达可能影响突触的一系列活动,并且促进树突棘的生成。另外,CaMKII在发育过程中的表达趋势与Actin并不完全一致。我们的结果表明突触的密度,Actin在树突棘的含量以及突触后效能在不同发育阶段中对神经网络活动水平的响应不同。该结果为揭示突触稳态可塑性的分子机制提供了新的视角与线索。微管马达蛋白Dynein及其激活因子Dynactin以形成复合物的方式驱动囊泡运输以及有丝分裂纺锤体的组织。Dynactin在真核细胞中有着非常广泛的表达。P150^Glued是Dynactin复合物中最大和最重要的亚基,该亚基在Dynactin结合Dynein以及微管过程中起着重要的作用。P150^Glued中G59S突变体将会导致运动神经元中特异的退行性病变。我们发现正是位于保守的CAP-Gly结构域的G59S突变,导致此结构域的折叠方式发生变化,从而降低了P150^Glued与F-box蛋白质FBXL5的亲和力,干扰了其通过泛素化-蛋白酶体降解的正常循环,为P150^GluedG59S蛋白在体内及体外的聚集造成神经退行性病变找到一种可能的致病机制。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第一章绪论  8-22
  1.1 神经网络与突触可塑性  8-14
    1.1.1 神经网络  8-9
    1.1.2 活动依赖的突触可塑性  9-10
    1.1.3 Hebb 假说与稳态可塑性  10-11
    1.1.4 突触的功能可塑性与结构可塑性  11-12
    1.1.5 突触蛋白  12-14
  1.2 神经退行性疾病与 P150GluedG59S 突变体  14-22
    1.2.1 Dynactin 复合物与P150Glued  15-17
    1.2.2 G59S 突变体与运动神经元退行性疾病  17-18
    1.2.3 细胞内蛋白降解途径与泛素-蛋白酶体系统  18-20
    1.2.4 分子伴侣系统  20-22
第二章材料与方法  22-36
  2.1 实验材料  22-23
    2.1.1 所用的质粒载体及其来源  22
    2.1.2 所用抗体来源  22
    2.1.3 所用细胞系来源  22
    2.1.4 所用试剂来源  22-23
  2.2 实验方法  23-33
    2.2.1 氯化铷方法制备 E.coli 感受态细胞  23-24
    2.2.2 酵母感受态制备和转化  24-25
    2.2.3 聚合酶链式反应（PCR：polymerase chain reaction）扩增基因  25-26
    2.2.4 琼脂糖电泳及DNA 片段的回收  26
    2.2.5 酶切反应  26
    2.2.6 DNA 片段的连接反应  26-27
    2.2.7 质粒转化  27
    2.2.8 质粒 DNA 的小量制备  27-28
    2.2.9 大批量质粒的提取  28-29
    2.2.10 小量蛋白表达检测  29-30
    2.2.11 谷胱苷肽（GST）融合蛋白的制备  30-31
    2.2.12 GST pull down 实验  31-32
    2.2.13 蛋白质 Western 印迹法  32-33
  2.3 细胞学试验  33-36
    2.3.1 离体神经元网络培养  33
    2.3.2 磷酸钙转染传代细胞系  33-34
    2.3.3 低密度神经元高效钙转法(Jiang and Chen, 2006)  34-35
    2.3.4 神经元 FM 染色  35
    2.3.5 免疫沉淀  35-36
第三章结果与讨论  36-48
  3.1 不同发育阶段的突触结构可塑性对不同神经网络活动水平的响应不同  36-45
    3.1.1 量化神经元网络转染  36-39
    3.1.2 神经元树突棘发育  39-40
    3.1.3 不同发育阶段突触结构可塑性对不同神经网络活动的响应  40-44
    3.1.4 光致转换蛋白在观察突触精细结构中的应用  44
    3.1.5 讨论  44-45
  3.2 P150Glued 中的 G59S 突变引起蛋白聚集的机制  45-48
    3.2.1 G59S 突变体不能与FBXL5 相互作用  45-46
    3.2.2 G59S 不影响其与 PBD 结合  46
    3.2.3 讨论  46-48
参考文献  48-63
附录缩略语表  63-64
致谢  64

不同神经网络活动水平下突触结构可塑性与P150~(Glued)G59S突变体相关的神经退行性疾病机制的研究

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