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镉诱发肝细胞毒性及其胞内钙信号失调相互关系和硒的保护作用研究

作　者: 王莎莎
导　师: 陈龙
学　校: 南京师范大学
专　业: 动物学
关键词: 镉 肝细胞 原代培养 钙离子 堆积 硒
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 125次
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内容摘要


本文通过原代培养新生乳鼠肝细胞模型，运用细胞培养、荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜和生化分析等生物学技术，系统研究了镉负荷诱发肝细胞损伤以及肝细胞存活性、胞内MDA含量、Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性以及胞内Cai2+含量的变化，细胞培养上清液中LDH及AST的活性、白蛋白及Ca2+含量变化，较为深入地探讨了镉导致的肝细胞胞内Cai2+稳态失衡的可能机制；同时，还观察了硒干预镉诱发鼠肝细胞存活及其MDA含量和培养液中LDH活性的变化以及硒对镉暴露肝细胞内Ca2+稳态变化的影响。结果如下： 1 新生乳鼠肝细胞原代培养方法的建立 无菌分离新生乳鼠肝脏组织，采用胶原蛋白酶消化法分离肝细胞并使用无血清培养液HepatoZYME-SFM对其进行体外培养，通过形态学及台盼蓝染色法鉴定，分离的肝细胞细胞完整，呈球形或椭球形，存活率在90％以上。说明该方法是比较理想的肝细胞培养法，为科学研究提供了细胞模型平台。 2 镉诱发肝细胞毒性及其胞内游离Ca2+变化研究 原代培养乳鼠肝细胞，分为三个镉处理组和正常对照组，分别加入5、10、25μM CdCl2染毒以及等量D-hank’s溶液。结果显示：实验后12h，CdCl2导致肝细胞存活剂量依赖性下降；培养上清液LDH和AST的活力升高或显著升高，并且白蛋白含量大大降低。在CdCl2暴露12h后，细胞内MDA生成量增加处于较高水平，培养上清液Ca2+含量显著下降。进一步观察显示，在CdCl2暴露12h和24h后，肝细胞[Ca2+]i显著升高：胞内Ca2+-Mg2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活力12h与对照组无明显差异，至24h下降或明显下降。提示：CdCl2通过诱导肝细胞脂质过氧化和损伤，引发细胞存活下降和功能障碍而导致强烈毒性；镉暴露引发肝细胞[Ca2+]i异常增加可能是细胞损伤发展的重要机制，部分[Ca2+]i升高与胞外Ca2+的进入有密切关系。 3 镉诱发肝细胞胞内游离Ca2+堆积的机制探讨 原代培养乳鼠肝细胞，用Fluo-3／AM对生长良好的原代培养肝细胞闭光孵育，然后清洗并重悬肝细胞于有钙HBSS或无钙HBSS中，同时设计加或不加2-APB抑制剂（100μM）的情况，用激光共聚焦显微镜观察CdCl2（10μM）急性暴露引起的胞内钙离子荧光强度变化。结果显示：在仅有钙的HBSS中，CdCl2诱导肝细胞[Ca2+]i明显上升，包括开始的缓慢上升期和随后的持续升高期；在有钙的HBSS+2-APB中，CdCl2仅引起一个无开始上升期的缓缓升高；在无钙的

全文目录


摘要  8-10
summary  10-13
引言  13-15
第一部分 文献综述  15-47
  第一章 钙离子的生物学功能及其调控  16-28
    1 细胞内钙信号转导系统  16-18
      1.1 细胞内钙的分布  16
      1.2 胞内游离Ca~(2+)浓度的调节  16-18
        1.2.1 质膜上的钙转移系统  16-18
          1.2.1.1 质膜上的钙外排系统  16-17
          1.2.1.2 质膜上的Ca~(2+)内流体系  17-18
        1.2.2 细胞内Ca~(2+)转运体系  18
          1.2.2.1 内质网Ca~(2+)通道  18
          1.2.2.2 内质网Ca~(2+)泵  18
          1.2.2.3 线粒体钙通道  18
        1.2.3 Ca~(2+)信号的产生、终止  18
    2 细胞内钙离子失衡与疾病的关系  18-19
    3 钙离子与肝细胞  19-24
      3.1 肝细胞内的钙离子平衡调节  19-21
        3.1.1 肝细胞膜上Ca~(2+)转运及调节  20
        3.1.2 肝细胞内贮Ca~(2+)的分布与调控  20-21
      3.2 钙离子失衡与肝细胞损伤  21-22
        3.2.1 肝细胞损伤特点  21
        3.2.2 肝细胞钙超载发生机制  21-22
        3.2.3 钙超载引起肝细胞损伤的机制  22
      3.3 自由基与肝细胞内钙超载  22-23
      3.4 钙离子通道阻滞剂与肝细胞损伤  23-24
    参考文献  24-28
  第二章 化学污染物镉对肝脏的毒性作用及其机制  28-36
    1 镉对肝脏的毒性作用  28-29
      1.1 镉对肝脏功能的影响  28-29
      1.2 镉引起的肝脏疾病  29
    2 镉对肝脏的毒性机制  29-32
      2.1 镉诱发的氧自由基引起肝细胞脂质过氧化  29-30
      2.2 镉导致肝细胞内钙离子堆积及其稳态失调  30-31
      2.3 镉与线粒体  31
      2.4 其他  31-32
    参考文献  32-36
  第三章 硒的生物学特性及在镉诱导肝细胞损伤中的作用  36-47
    1 硒的生物学特性及作用  36-41
      1.1 硒的化学性质  36
      1.2 硒的分子生物学  36
      1.3 硒在生物体内的代谢  36-37
      1.4 硒蛋白  37-38
      1.5 硒的生物学功能  38-41
        1.5.1 硒的抗氧化作用  39-40
        1.5.2 硒对某些激酶活性的调节作用  40
        1.5.3 硒对机体免疫功能的调节作用  40
        1.5.4 硒对重金属毒性的拮抗作用  40
        1.5.5 其他  40-41
    2 硒在镉引起的肝脏损伤中的作用及其机制  41-42
      2.1 硒对镉诱导肝脏损伤的拮抗作用  41
      2.2 硒对镉引起肝脏损伤的保护作用机制  41-42
        2.2.1 硒对镉负荷肝细胞的抗氧化损伤保护作用  41-42
        2.2.2 硒对重金属镉的拮抗作用  42
    3 硒的毒性作用  42
    参考文献  42-47
第二部分 实验研究  47-83
  第四章 新生鼠肝细胞原代培养方法的建立  48-54
    摘要  48
    1 材料与方法  48-49
      1.1 实验动物  48
      1.2 主要药品与试剂  48-49
      1.3 实验方法  49
        1.3.1 肝脏细胞原代培养  49
        1.3.2 细胞存活率的检查  49
        1.3.3 肝细胞细胞形态学观察  49
        1.3.4 肝细胞鉴定  49
    2 结果  49-51
    3 讨论  51-52
    参考文献  52-53
    Abstract  53-54
  第五章 镉诱发肝细胞毒性及其胞内游离Ca~(2+)变化研究  54-65
    摘要  54-55
    1 材料与方法  55-56
      1.1 实验动物  55
      1.2 主要药品与试剂  55
      1.3 实验方法  55-56
        1.3.1 肝脏细胞原代培养  55
        1.3.2 CdCl_2暴露肝细胞存活性分析  55
        1.3.3CdCl_2暴露肝细胞及其培养液相关生化指标测定  55
        1.3.4 激光共聚劁业微镜和分光光度法分析CdCl_2暴露肝细胞［Ca~(2+)］变化  55-56
      1.4 数据处理  56
    2 结果  56-58
      2.1 CdCl_2暴露肝细胞培养液中AST和LDH活性以及白蛋白和Ca~(2+)含量变化  56-57
      2.2 CdCl_2暴露肝细胞存活性和MDA含量的变化  57
      2.3 CdCl_2暴露肝细胞[Ca~(2+)]_i荧光影像和强度及[Ca~(2+)]_i含量变化  57-58
      2.4 CdCl_2暴露肝细胞Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase和Na~+-K~+-ATPase活性变化  58
    3 讨论  58-61
    参考文献  61-64
    Abstract  64-65
  第六章 镉诱发肝细胞胞内游离Ca~(2+)堆积的机制探讨  65-74
    摘要  65-66
    1 材料与方法  66-67
      1.1 主要药品与试剂  66
      1.2 实验动物  66
      1.3 实验方法  66-67
        1.3.1 肝脏细胞培养  66
        1.3.2 实验分组及处理  66
        1.3.3 肝细胞的Fluo-3／AM负载  66
        1.3.4 激光扫描共聚焦显微镜断层扫描  66-67
      1.4 图像分析与数据处理  67
    2 结果  67-69
      2.1 肝细胞在有外钙时镉诱导[Ca~(2+)]_i荧光强度变化  67
      2.2 肝细胞在有外钙和2-APB时镉诱导[Ca~(2+)]_i荧光强度变化  67
      2.3 肝细胞在无外钙时镉诱导[Ca~(2+)]_i荧光强度变化  67
      2.4 肝细胞在无外钙而有2-APB时镉诱导[Ca~(2+)]_i荧光强度变化  67-69
    3 讨论  69-70
    参考文献  70-73
    Abstract  73-74
  第七章 硒对镉诱发肝细胞毒性和胞内Ca~(2+)变化的保护作用研究  74-83
    摘要  74-75
    1 材料与方法  75-76
      1.1 肝细胞的分离  75
      1.2 肝细胞存活实验  75
      1.3 肝细胞损伤相关生化指标分析  75
      1.4 肝细胞胞内游离Ca~(2+)水平([Ca~(2+)]_i)分析  75-76
      1.5 数据处理  76
    2 结果  76-78
      2.1 镉对离体肝细胞存活的影响及硒干预作用  76
      2.2 镉对离体肝细胞MDA含量及其培养液中LDH活性影响及硒干预作用  76-77
      2.3 镉对离体肝细胞[Ca~(2+)]_i的影响及硒干预作用  77-78
    3 讨论  78-80
    参考文献  80-82
    Abstract  82-83
第三部分 全文结讼  83-85
  全文结论  84-85
致谢  85-86
附1  86

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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