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不同时间血液灌流对脓毒症兔促炎细胞因子及生存时间影响

作　者: 纪国业
导　师: 王斌
学　校: 南方医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 血液灌流脓毒症兔细胞因子
分类号: R459.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景脓毒症(sepsis)是由感染所致的全身炎症反应综合征,证实有细菌存在或有高度可疑感灶。脓毒症-严重脓毒症-脓毒症休克-多脏器功能障碍-多脏器功能衰竭-死亡是很多病人的最终转归。目前,脓毒症的发病机制主要包括：宿主自身免疫性损伤、肠道细菌移位和肠源性内毒素血症、炎症系统和凝血系统稳态失衡、微循环和线粒体功能障碍综合征。当病原体侵入机体时,会引起机体免疫应答反应。当免疫炎症反应失控时,就会引起细胞因子风暴和炎症介质瀑布而导致脓毒症。细菌感染可以用抗生素来治疗,但是我们却无法恢复肠道的屏障功能。而且抗生素杀死了细菌,也造成了内毒素的大量释放。在这过程中,内毒素中的脂多糖(LPS)与宿主免疫系统作用后所激发的促炎细胞因子的分泌,与脓毒症的严重程度及预后有密切关系。在这些促炎的细胞因子中,最重要的有TNF-α、IL-1、IL-6等。TNF-α：作为始发的细胞因子,其核心作用是在炎性反应中激活细胞因子级联反应,诱发IL-1、IL-6、前列腺素等的分泌,由此激发炎症连锁反应。TNF-α可引起发热,诱导肝细胞急性期蛋白合成,并直接促进内皮细胞黏附中性粒细胞、单核细胞、嗜中性多型核白细胞(PMN)进入炎症部位,释放细胞因子,参与和放大SIRS,从而在启动脓毒血症过程中起主导作用。IL-1：协同TNF-α启动脓毒血症的炎症反应,引起发热,诱导肝细胞急性期蛋白合成,刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF,并通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导对中性粒细胞的趋化作用,在脓毒症发展过程中起放大作用。IL-6：不仅能激活中性粒细胞,而且还能延迟吞噬细胞对衰老和丧失功能的中性粒细胞的吞噬,从而加剧了炎症介质的产生；并可导致免疫功能失调。因此,阻断和减少上述前炎症细胞因子,或能成为有效治疗脓毒症的方法之一血液净化(blood purification)是指把患者血液引出体外并通过一种净化装置,除去其中某些致病物质,净化血液,达到治疗疾病的目的,这个过程即为血液净化。血液灌流(hemoperfusion, HP)治疗技术将病人动脉血流经管道引向灌流器,血液经过灌流器时受到吸附剂或其他生物材料的作用而得到净化或生化处理,灌流后的血液再经管路返回静脉。HA型树脂血液灌流器中的吸附剂是由苯乙烯/二乙烯苯聚合而成的大孔高分子聚合物,属中性大孔树脂,其通过调节反应体系温度、搅拌速度,采用高分子悬浮聚合方法,控制交联度和选择致孔剂调节树脂孔径到特定的区间,选择富含亲脂疏水基团的交联剂进行交联使树脂吸附剂具有亲脂疏水性,合理调节包膜液体系沸点和干燥温度调节膜孔径,然后选择包膜液浓度和干燥速度控制膜厚度制作而成。生物相容性好,其吸附机理主要是通过中性大孔吸附树脂作为吸附剂直接吸附清除血液中的相关致病物质,利用树脂分子的三维网状结构的分子筛作用行物理吸附与疏水基团的相互作用。特点是吸附容量大,吸附速度快,机械强度高,具有相对吸附特异性,能有效清除血中病理性分子,特别是对中大分子及蛋白质结合的病理性分子有相对特异性的吸附能力。目前临床上已广泛用于脓毒症病人的治疗。但在脓毒症何时行血液灌流效果最佳?目前在国内外尚无确定的答案。本文设想通过盲肠结扎穿孔法造成脓毒症兔模型,然后根据盲肠结扎穿孔术后时间的不同,分组并分别对兔进行单次血液灌流,同时通过多个时间点检测血清中与脓毒症密切相关的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6浓度,比较其变化,并结合与脓毒症预后密切相关的各实验兔生存时间,以找出脓毒症兔血液灌流最佳时机,从而为临床脓毒症病人血液灌流治疗时间的选择提供一个动物实验依据,以期改善脓毒症患者的预后。目的：通过检测兔血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及工L-6随血液灌流选择的时间不同而发生的浓度变化,结合生存时间,探讨脓毒症兔行血液灌流最佳时机。方法：1、42只雄性新西兰大白兔随机分成7组,每组6只,每只兔用戊巴比妥钠静脉麻醉后,均通过盲肠结扎穿孔法(CLP)制作脓毒症模型,并行股动静脉置管术以留待血液灌流的需要构成血液管路通道。2、各组分别在CLP术后3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、36小时用自制血液灌流器行单次血液灌流,灌流时间为2小时,速度为5ml/min；空灌流组则在CLP术后3小时行空灌流(用空灌流器灌流)作为实验对照。3、各组兔在CLP手术前,术后3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、36小时、48小时一共8个时间点抽取外周血标本2mL,离心后血清用ELISA法试剂盒集中检测,板孔反应完毕加入终止液后用酶标仪在450nm波长测出0D值。利用标准孔0D值通过SPSS软件求出回归方程,把各标本0D值代入方程,即可得到各血标本TNF-α、IL-1β及IL-6浓度。4、兔固定在手术台上至死亡,定时观察兔精神、呼吸、心率、体温情况,并每天静脉补充液体,液体量按80ml/kg,包括0.9%生理盐水及10%葡萄糖溶液,总张力为1/4,记录生存时间。5、统计软件采用SPSS13.0, IL-6、IL-1β及TNF-α的浓度均用两因素多水平的重复测量方差分析,干预因素为血液灌流(分7组),测量时间因素有8个水平(8个测量点)。并分别对三个指标作线性相关性分析。生存时间用生存分析Kaplan-Meier法,并绘制生存曲线。检验水准定为α=0.05。结果：1、观察指标结果：42只兔CLP术后约12小时均开始出现体温升高,精神倦怠、呼吸、心率逐渐增快等症状,均于术后48小时至90小时间死亡。死后解剖兔,腹腔内均可见肠管表面及腹膜上有脓性分泌物,脓性或血性腹水,味臭,结扎部位下颜色黑紫,质脆,并与周围肠管及腹膜粘连。兔生存时间采用生存分析(Kaplan-Meier法),结果示各灌流组总体差异具有统计学意义(Chi-Square:57.313, P<0.001);两两比较,12h灌流组生存时间最长(78.667+8.262小时)2、检测指标结果：(1)TNF-α：重复测量方差分析球形检验：W=0.000,P<O.001,不满足球形假设,Greenhouse-Geisser校正系数为：0.265。主效应：不同灌流组间总体差异具有统计学意义,F值为18.231,P<O.001；重复测量因素8个不同时间点总体间差异具有统计学意义,F值为179.566,P<0.001.。各灌流组间两两比较(LSD法)：以术后3小时灌流组TNF-α平均浓度最低(80.750pg/ml),差异具有统计学意义；各重复测量点间两两比较：以术后6小时测量点TNF-α平均浓度最高(937.287 pg/ml),差异具有统计学意义。交互效应及单独效应：重复测量时间与不同灌流组交互水平：F值为5.531,P<0.001,说明重复测量时间与不同灌流组间有交互作用。当空灌流组在术后6小时的时候,TNF-α平均浓度最高。(2)IL-1β：重复测量方差分析：球形检验：W=0.000,P<0.001,不满足球形假设,Greenhouse-Geisser校正系数为：0.150。主效应：不同灌流组总体间差异具有统计学意义,F值8.391,P<O.001；重复测量因素8个不同时间点总体间差异具有统计学意义,F值96.566,P<O.001。各灌流组间两两比较(LSD法)：以术后6h灌流组IL-1β平均浓度最低(36.160 pg/ml)；各重复测量点间两两比较：以术后9小时测量点TNF-α平均浓度最高(265.251 pg/ml)。交互效应及单独效应：重复测量时间与不同灌流组交互水平：F值4.328,P=0.002,说明重复测量时间与不同灌流组间有交互作用。当24h灌流组在术后9小时的时候,IL-1β平均浓度最高。(3)IL-6：重复测量方差分析：球形检验：W=0.000,P<0.001,不满足球形假设,Greenhouse-Geisser校正系数为：0.162。主效应：不同灌流组总体间差异具有统计学意义,F值2.394,P=0.048；重复测量因素8个不同时间点总体间差异具有统计学意义,F值为91.880,P<0.001。各灌流组间两两比较(LSD法)：以术后12h灌流组IL-6平均浓度最低(521.957 pg/ml)；各重复测量点间两两比较：以术后12小时测量点IL-6平均浓度最高(4492.715 pg/ml)交互效应：重复测量时间与不同灌流组交互水平：F值为0.903,P=0.512,说明重复测量时间与不同灌流组间无交互作用。结论：在脓毒症早中期(CLP术后3小时至术后12小时)血液灌流能最有效地降低脓毒症兔血TNF-α、IL-1β及IL-6浓度,且在脓毒症中期行血液灌流(CLP术后12小时)还能使兔生存时间达到最长；表明在临床上,血液灌流在脓毒症早中期进行,或能最有效地降低病人的促炎细胞因子,改善预后。

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摘要 3-8ABSTRACT 8-16前言 16-21 1 脓毒症概念及细胞因子在其中的作用 16-18 2、血液灌流原理及临床应用 18-19 3、临床面临问题及论文研究目的 19-21第一章兔脓毒症及动静脉置管模型的制备 21-29 1 兔脓毒症模型的制备 21-24 2 股动静脉置管 24-27 3 模型讨论 27-29第二章不同时间血液灌流对脓毒症免促炎细胞因子及生存时间的影响观察 29-53 1 材料和方法 29-35 2 结果 35-46 3 讨论 46-51 4 结论 51-53综述 53-62参考文献 62-66学位期间成果 66-67致谢 67-69统计学证明 69

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