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IHHN、TS的流行病学调查和TSV结构蛋白VP1、VP3相互作用的研究

作　者: 李明
导　师: 费荣梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性皮下及造血组织坏死病 桃拉综合征病毒 流行病学调查 VP1 VP3 蛋白相互作用
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


桃拉综合征(Taura Syndrome, TS)是一种严重危害对虾养殖的病毒病,它是由桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)引起的。TSV的主要宿主是凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和细角对虾(P. stylirostris),并且具有高爆发率和致死率。对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)也是严重危害对虾养殖的一种病原体,主要宿主是红额角对虾(Penaeus stylirostris),其宿主也十分广泛。本文主要对江苏地区对虾TS和IHHN进行了流行病学调查。为了研究江苏地区的TSV和IHHNV的流行情况,从2008年11月至2010年10月,对江苏省盐城、连云港等地的对虾养殖场,及南京市市场上的对虾和其他虾种进行为期2年的采样,共采样718尾,并进行检测,检测结果发现,无论是在市场还是养殖场的对虾都没有TSV的检出；而检测IHHNV时,则是虾体没有出现明显的病变,但在对虾机体内IHHNV却广泛存在,718尾样品中有144尾检出IHHNV存在,阳性率为20.0%。凡纳滨对虾、中国对虾、斑节对虾IHHNV携带率较高,其他虾种检出率较少；6月份、7月份、10月份对虾的IHHNV检出率较高,而相对寒冷的冬季,12月份到次年的3月份,IHHNV的检出率较低。TSV的主要结构蛋白有三个,分别为VP1(55kD),VP2(40kD)和VP3(24kD)。本文对桃拉病毒结构蛋白VP1和VP3分别进行表达,并对这两个结构蛋白之间的相互作用进行研究。根据TSV中国株ZHZC3的全基因组序列,对VP1,VP3分别设计扩增引物,利用RT-PCR技术对目的基因进行了扩增。再将目的基因与pColdTMTF载体连接,分别构建高效表达重组载体pCold-VP1、pCold-VP3.将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3),重组载体经酶切、测序鉴定正确。而后进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,均为上清表达。融合蛋白pCold-VP1、pCold-VP3经His-TrapTMHP纯化后用透射电镜观察并未有颗粒状物质出现。根据桃拉病毒中国株ZHZC3的全基因组序列,对VP1进行重新设计扩增引物,扩增后与pGEX-4T-3载体连接,并转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,将表达后的融合蛋白与用pCold-VP3融合蛋白,进行pull down试验,结果表明,结构蛋白VP1和VP3之间,并无明显相互作用。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12第一篇 文献综述  12-38  第一章 桃拉综合征病毒的研究进展  12-28    1 引言  12    2 桃拉病毒的发现  12-13    3 病原学  13-14    4 流行病学  14      4.1 宿主动物  14      4.2 传播途径和机制  14    5 临床症状和病理变化  14-15    6 诊断  15-18      6.1 传统方法  15-16      6.2 免疫学方法  16-17      6.3 分子生物学方法  17-18    7 桃拉综合征病毒的分子生物学特征  18-21      7.1 基因结构  18-19      7.2 基因的多样性  19-21      7.3 基因表达  21    8 小结  21-23    参考文献  23-28  第二章 传染性皮下及造血组织坏死病毒的研究概况  28-38    1 引言  28    2 病原学  28-29    3 流行病学  29-30      3.1 宿主动物  29      3.2 传播途径  29-30    4 临床症状和病理变化  30-31    5 诊断  31-34      5.1 传统方法  31-32      5.2 免疫学方法  32      5.3 分子生物学方法  32-34    参考文献  34-38第二篇 实验研究  38-82  第三章 桃拉综合征和传染性皮下及造血组织坏死病的流行病学调查  38-56    1 材料  39-40      1.1 参考毒株  39      1.2 样品采集及预处理  39      1.3 试剂  39      1.4 主要仪器设备  39-40      1.5 主要溶液的配制  40      1.6 引物设计  40    2 方法  40-45      2.1 样品的处理  41      2.2 病毒核酸的提取  41-42      2.3 TSV的检测  42-44      2.4 IHHNV的检测  44-45    3 结果与分析  45-51      3.1 TSV的检测结果  45-47      3.2 IHHNV的检测结果  47-51    4 讨论  51-53    参考文献  53-56  第四章 桃拉综合征病毒(TSV)结构蛋白VP1和VP3的表达  56-70    1 材料  56-57      1.1 毒株  56-57      1.2 菌株  57      1.3 主要酶和试剂  57      1.4 主要仪器设备  57      1.5 PCR引物设计  57    2 方法  57-61      2.1 病毒总RNA的提取  57-58      2.2 RT-PCR  58      2.3 PCR产物的鉴定、回收与纯化  58      2.4 PCR产物的T/A连接  58-59      2.5 连接产物的转化  59      2.6 阳性克隆的PCR鉴定  59      2.7 重组质粒pCold-VP1/VP3的构建  59      2.8 连接产物的转化  59-60      2.9 重组质粒pCold-VP1/VP3的双酶切鉴定  60      2.10 测序分析  60      2.11 重组蛋白的诱导表达  60      2.12 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达  60-61      2.13 pCold-VP1/VP3重组蛋白的纯化  61      2.14 电镜观察pCold-VP1/VP3重组蛋白  61    3 结果  61-65      3.1 TSV检测结果  61-62      3.2 目的基因的RT-PCR扩增及重组质粒pCold-VP1/VP3双酶切鉴定结果  62-63      3.3 融合蛋白的诱导表达  63-64      3.4 上清的纯化  64-65      3.5 pCold-VP1/VP3重组蛋白的电镜观察结果  65    4 讨论  65-68    参考文献  68-70  第五章 桃拉综合征病毒(TSV)结构蛋白VP1与VP3之间的相互作用  70-77    1 材料  71      1.1 毒株  71      1.2 菌株  71      1.3 主要酶和试剂  71      1.4 主要仪器设备  71      1.5 PCR引物设计  71    2 方法  71-74      2.1 病毒总RNA的提取  71-72      2.2 RT-PCR  72      2.3 PCR产物的鉴定、回收与纯化  72      2.4 PCR产物的T/A连接  72      2.5 连接产物的转化  72      2.6 阳性克隆的PCR鉴定  72      2.7 重组质粒pGEX-VP1的构建  72-73      2.8 连接产物的转化  73      2.9 重组质粒pGEX-VP1的双酶切鉴定  73      2.10 测序分析  73      2.11 重组蛋白的诱导表达  73-74      2.12 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达  74      2.13 Pull-Down分析  74    3 结果  74-77      3.1 目的基因的RT-PCR扩增及重组质粒pGEX-VP1双酶切鉴定结果  74-76      3.2 融合蛋白的诱导表达  76      3.3 Pull-Down分析  76-77  4 讨论  77-79  参考文献  79-82全文总结  82-84附录  84-86致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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