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核蛋白NDP52与肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6相互作用及临床意义的研究

作 者: 孙利
导 师: 汪思应;杨晓明
学 校: 安徽医科大学
专 业: 病理学与病理生理学
关键词: 蛋白质相互作用 NDP52 TRAF6 NF-κB 肝细胞肝癌
分类号: R363
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-KB)是近年来颇受关注的一组重要因子,作为可诱导并普遍存在的转录因子,对众多基因发挥中心性转录调节作用,从而在免疫、炎症、细胞的生存、增殖、分化和凋亡、肿瘤的形成等方面起到广泛而重要的作用。NDP52是ND10(核蛋白)组成成员之一,该蛋白在肝组织中表达量最高,能够与其它分子相互作用最终引起细胞生命效应,与病毒的感染,炎症的形成,肿瘤的发生发展有明确的相关性。研究发现,该蛋白可能与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)共同参与NF-KB信号通路的调节,但调控机制尚未清除。为进一步阐明NDP52和TRAF6在NF-KB信号通路中的调控机制,及其与肝癌发生发展的关系,我们以酵母双杂交筛选成人肝脏cDNA文库得到的未知相互作用对NDP52与TRAF6为研究对象,通过一系列实验验证了两者的相互作用,并为阐明NF-κB信号通路的分子机制及肝癌发生机制提供了新的线索。前期实验以TRAF6为诱饵质粒,采用酵母双杂交技术筛选成人肝脏cDNA文库得到相互作用对NDP52与TRAF6。我们通过外源免疫共沉淀实验,GST-Pull down实验和和荧光共定位实验等确认NDP52和TRAF6间存在生理性相互作用。转录活性实验发现,过表达NDP52时,对TRAF6介导的NF-κB信号起着负调控作用,随着NDP52量的增加,这种负调控逐渐增强。除了TRAF6以外,NDP52与TRAF6家族的其它成员TRAF1,TRAF2,TRAF3和TRAF5也存在相互作用,其相互作用也可以影响NF-κB的转录活性。通过Western blot实验检测了NDP52在不同肝癌细胞和其他癌细胞中的表达。细胞免疫荧光实验证实了NDP52蛋白在恶性黑色素瘤A375,肝癌细胞(HCC cell)(7721)中表达,细胞质和细胞核中都有分布,主要在细胞核内分布。肝细胞癌免疫组化实验结果看,NDP52蛋白在肝癌组织的细胞核表达量有有上升的趋势,而在正常对照的肝组织中表达量非常少。同时我们采用酶联免疫吸附实验实验检测了肝细胞肝癌病人血清中NDP52蛋白含量的多少。ELISA实验结果显示,在肝细胞肝癌病人血清中NDP52蛋白含量高于对照组正常人血清中NDP52的含量。NDP52与TRAF6存在生理性相互作用,在探知NDP52和TRAF6的相互作用是否影响NF-κB信号通路时,我们发现过表达NDP52时,对TRAF6介导的NF-κB信号起着负调控作用,随着NDP52量的增加,这种负调控逐渐增强。除了TRAF6以外,NDP52与TRAF6家族的其它成员TRAF1,TRAF2,TRAF3和TRAF5也存在相互作用,其相互作用也可以影响NF-κB的转录活性。确定NDP52与TRAF6在体内存在相互作用后,我们推测NDP52与TRAF6应该有相同的亚细胞定位,免疫荧光实验验证了我们的推测,NDP52与TRAF6相互作用的生理功能是发生在细胞质中。通过Western blot实验检测了NDP52在不同肝癌细胞和其他癌细胞中的表达,从选择的几种肝癌细胞的裂解液来看,在几种肝癌细胞中均有NDP52的表达;而在其他几种非肝癌的癌细胞中NDP52也有表达,说明NDP52并非肝癌细胞特异性表达蛋白。细胞免疫荧光实验证实了NDP52蛋白在恶性黑色素瘤(A375),肝癌细胞(7721)中表达,细胞质和细胞核中都有分布,但主要是在细胞核。从肝细胞癌免疫组化实验结果看,NDP52蛋白在I级、II级、III级肝癌组织的细胞核表达量有有上升的趋势,与肿瘤的分化程度似乎相关联,而在正常对照的肝组织中表达量非常少。同时我们采用酶联免疫吸附实验检测了20例肝细胞肝癌病人血清中NDP52蛋白含量,ELISA实验结果显示,在肝细胞肝癌病人血清中NDP52蛋白含量高于对照组正常人血清中NDP52的含量。本研究发现NDP52对NF-κB信号通路具有抑制作用,而且这种负调控作用很可能是在TRAF6的水平来实现的,这为阐明NF-κB信号通路的分子机制提供新的线索。明确了NDP52与TRAF6相互作用的亚细胞定位,同时发现NDP52与肝细胞肝癌相关,填补了NDP52与何种疾病相关这一空缺,让我们重新认识了NDP52新的功能角色,为进一步的NDP52功能研究奠定了坚实的基础。

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主要英文缩写一览表  5-6中文摘要  6-8ABSTRACT  8-11主要仪器设备和常用试剂的配制  11-15  一、主要仪器设备  11-12  二、常用溶液的配制  12-15前言  15-20第一部分 NDP52TRAF6 相互作用及其对 NF-KB 信号通路的调控  20-42  1 材料与方法  20-32  2 结果与分析  32-41  3 讨论  41-42第二部分 NDP52 在细胞组织中的表达及其临床意义  42-51  1. 材料与方法  43-47  2. 结果  47-50  3. 讨论  50-51全文总结  51-52参考文献  52-56附录一 目的基因 PCR 扩增和鉴定引物  56-58附录二 个人简历  58-59附录三 致谢  59-60综述 蛋白质相互作用的研究技术  60-67  参考文献  65-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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