学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

山羊骨髓间充质干细胞生物学特性、冷冻保存及基因转染研究

作　者: 黄荣
导　师: 王锋
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 骨髓间充质干细胞 生物学特性 冷冻保存 基因转染
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 6次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类能高度增殖和自我更新,并具有多向分化潜能的成体干细胞。目前,已在人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛和羊等物种进行了研究,证明该类细胞在一定条件下能分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞和星形胶质细胞等多种成体细胞。另外,研究还发现BMSCs转染效率较高,是一种理想的核移植供体细胞。因此,BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今关于山羊BMSCs分离培养、冷冻保存以及转基因等方面的系统研究报道甚少。因此,本试验利用黄淮山羊为对象,较系统全面地研究了BMSCs的分离培养、生长特性、细胞表面标志、体外诱导分化能力、冷冻保存体系以及基因转染效率等。具体研究内容如下：1.山羊BMSCs的分离培养和生物学特性研究从增殖情况、基因表达和分化潜力三方面对山羊BMSCs的生物学特性进行研究。采用全骨髓贴壁法分离培养原代BMSCs,结果显示山羊BMSCs体外生长状态良好,镜下可见贴壁细胞增殖明显,培养9d即基本汇合,细胞形态均一,大部分呈梭形；传代后,以计数法检测第1代细胞和第7代细胞增殖水平,并绘制生长曲线,曲线呈“s”形,符合细胞生长的一般规律；取第5代细胞接触抑制2d后用流式细胞仪检测细胞周期,结果89.69%的细胞处于G0/G1期,同期化程度较高；通过免疫荧光法和RT-PCR检测,发现山羊BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106和CD166等表面标志,但是不表达造血干细胞的表面标志CD45；最后,用成骨细胞、脂肪细胞诱导剂成功诱导BMSCs定向分化为成骨细胞和脂肪细胞,鉴定其具有分化能力。2.山羊BMSCs冷冻保存研究从山羊BMSCs冷冻保存时冻存液的种类、浓度和冷冻程序优化其冷冻保存。首先研究冷冻保存对山羊BMSCs生物学特性的影响,结果复苏后细胞的生长曲线依然呈“S”型,同时用流式细胞仪检测接触抑制2d的山羊BMSCs细胞周期,结果显示G0/G1期的细胞达89.45%,与冷冻前比较,差异不明显。然后试验研究了DMSO浓度、蔗糖浓度以及三种冷冻程序对细胞冻存的影响：(1)采用分级冷冻法冷冻细胞,研究含有2.5%、5%和10%DMSO的冻存液对山羊BMSCs冷冻效果的影响,结果,当DMSO含量为2.5%时,复苏后细胞活率为(97.76+1.3)%,显著高于5%和10%试验组,然而三组细胞24 h后的贴壁率差异并不显著；(2)采用分级冷冻法冷冻细胞,在含有10%DMSO的冻存液中,分别添加0.05 M、0.15 M和0.25 M的蔗糖,结果发现这三个试验组复苏后细胞活率差异不显著,另外三组之间24 h贴壁率差异也不显著；(3)采用含有10%DMSO的冻存液,应用三种冷冻程序对山羊BMSCs进行冷冻保存,分别为：分级冷冻法、异丙醇控温盒冷冻法和直接-80℃冷冻法,结果发现直接-80℃冷冻法复苏后细胞活率显著高于其他两组,但是三个试验组24 h贴壁率差异不显著。结果表明,2.5%的DMSO可以满足山羊BMSCs冻存的需要,并且分级冷冻法较适合该细胞的冷冻。3.山羊BMSCs基因转染研究研究山羊BMSCs的基因转染效率。本试验将pEGFP-C1分别转染山羊耳成纤维细胞和山羊BMSCs,进行转染效率比较,结果显示：山羊BMSCs对脂质体LTX较敏感,以敏感细胞的体系进行转染(100μL LDMEM-LG中加入0.25μg质粒、0.5μLPLUSTM Reagents和1.25μL LipofectamineTM LTX),细胞依然呈纤维样且死亡较少,山羊BMSCs转染效率达(67.91±5.3)%,显著高于山羊耳成纤维细胞转染效率(17.79±3.9)%,说明山羊BMSCs是一种转染效率较高的转基因核移植供体细胞。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩略语  12-13第一篇 综述部分  13-41  第一章 BMSCs研究概况  13-25    1 BMSCs的发现和来源  13    2 BMSCs的分离纯化和体外扩增  13-16      2.1 BMSCs分离纯化  13-14      2.2 BMSCs体外扩增  14-16    3 BMSCs的生物学特性  16-17      3.1 形态  16      3.2 细胞周期  16      3.3 表面标志  16-17      3.4 免疫学特性  17      3.5 BMSCs的归巢  17    4 BMSCs多向分化的研究进展  17-20      4.1 向成骨细胞分化  18      4.2 向软骨细胞分化  18      4.3 向脂肪细胞分化  18-19      4.4 向肌肉细胞分化  19      4.5 向心肌细胞分化  19      4.6 向表皮细胞分化  19      4.7 向肌腱分化  19      4.8 向神经细胞分化  19      4.9 向其他细胞分化  19-20    5 BMSCs应用前景和存在问题  20-21    参考文献  21-25  第二章 细胞冻存的研究概况  25-33    1 冷冻保护剂  25-27      1.1 渗透性冷冻保护剂  25-26      1.2 非渗透性冷冻保护剂  26      1.3 抗冻蛋白  26-27      1.4 单一冷冻保护剂  27      1.5 联合冷冻保护剂  27    2 低温保存方法  27-28      2.1 慢速冷冻法  28      2.2 玻璃化冷冻法  28    3 BMSCs的低温保存  28-30      3.1 BMSCs的低温保存现状  29      3.2 BMSCs低温保存面临的问题  29-30    参考文献  30-33  第三章 核移植供体细胞的选择  33-41    1 供体细胞的来源  33-34    2 供体细胞的细胞周期  34-35    3 供体细胞的代数  35    4 供体细胞的年龄  35-36      4.1 来自特定基因表达的影响  35-36      4.2 供体细胞的端粒酶活性  36    5 供体细胞的基因转染效率  36-37    参考文献  37-41第二篇 试验部分  41-73  第四章 山羊BMSCs的分离培养和生物学特性研究  41-53    1 引言  41-42    2 材料与方法  42-45      2.1 试验材料  42      2.2 试验方法  42-45    3 结果与分析  45-49      3.1 山羊BMSCs的分离培养  45-46      3.2 山羊BMSCs的生长曲线  46      3.3 山羊BMSCs的细胞周期  46-47      3.4 山羊BMSCs的鉴定结果  47-49    4 讨论  49-51      4.1 山羊BMSCs的分离方法  49      4.2 BMSCs的表面标志  49      4.3 BMSCs的多向分化潜能  49-51    参考文献  51-53  第五章 山羊BMSCs冷冻保存研究  53-63    1 引言  53    2 材料与方法  53-56      2.1 试验材料  53-54      2.2 试验方法  54-56    3 结果与分析  56-59      3.1 冻存后山羊BMSCs的生长曲线  56-57      3.2 冻存后山羊BMSCs细胞周期  57      3.3 不同浓度DMSO对山羊BMSCs冻存的影响  57-58      3.4 不同浓度蔗糖对山羊BMSCs冻存的影响  58-59      3.5 不同冷冻程序对山羊BMSCs冻存的影响  59    4 讨论  59-61      4.1 冷冻保存后山羊BMSCs的生物学特性  59-60      4.2 冷冻保护剂对山羊BMSCs冷冻效果的影响  60      4.3 冷冻程序对山羊BMSCS冷冻效果的影响  60-61    参考文献  61-63  第六章 山羊BMSCs基因转染研究  63-73    1 引言  63    2 材料与方法  63-67      2.1 试验材料  63-64      2.2 试验方法  64-67    3 结果与分析  67-70      3.1 pEGFP-C1质粒扩增结果  67-68      3.2 pEGFP-C1转染山羊BMSCs结果  68-70    4 讨论  70-72    参考文献  72-73全文结论  73-75发表文章  75-77致谢  77

相似论文

  1. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  2. 聚乙烯亚胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究,R450
  3. 河南低致病性禽流感病毒（H9亚型）分离鉴定及生物学特性研究,S852.65
  4. 苏丹草叶斑病原平脐蠕孢菌的研究,S435.4
  5. 树鼩和猕猴精子冷冻保存工艺的创建和优化的研究,S865.1
  6. 豆柄瘤蚜茧蜂田间动态及其生物学特性研究,S476.3
  7. 新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用,R346
  8. 兔骨髓间充质干细胞分离培养及定向分化的研究,R329
  9. 茶黄素与TGF-β3对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞增殖和诱导分化地影响,R329
  10. 骨髓间充质干细胞预移植1周对大鼠心肌缺血再灌损伤的修复作用,R542.22
  11. 第三方骨髓间充质干细胞诱导同种异体移植受体免疫耐受机制的研究,R392
  12. 慢病毒介导hVEGF-165基因转染骨髓间充质干细胞治疗大鼠后肢缺血实验研究,R329
  13. 心梗后骨髓间充质干细胞移植的最佳时间研究,R542.22
  14. 白蜡吉丁啮小蜂生物学及耐寒性研究,S476.3
  15. 大鼠骨髓间充质干细胞p38MAPK信号通路对机械应力刺激的反应,R329
  16. 骨髓间充质干细胞的营养效应对一氧化碳致星形胶质细胞损伤的影响,R329
  17. BMP2和VEGF165在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达,R329
  18. 缺氧预处理MSCs移植对心肌梗死区SDF-1/CXCR4轴表达变化的实验研究,R542.22
  19. 骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤移植途径的实验研究,R651.2
  20. 碳化二亚胺交联的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱生物学特性研究,R687.2

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
© 2012 www.xueweilunwen.com