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人乳腺癌细胞系MCF7耐阿霉素的机制分析

作　者: 陈淑娴
导　师: 金坚; 付强
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 乳腺癌多药耐药阿霉素转录因子 γ-tocotrienol HPLC FPP&GGPP
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目前，肿瘤的治疗失败的关键原因之一是肿瘤自身的多药耐药。虽然研究表明了多种可能的机制，但其明确的机制依然未知。本论文以肿瘤治疗的常用药物阿霉素为实验对象，主要通过分析阿霉素在野生型细胞（MCF7/W）和耐药细胞（MCF7/ADM）中的分布、代谢变化、转录因子表达差异以及耐药标记性蛋白分析，维生素E类似物γ tocotrienol对细胞耐药的逆转作用等实验手段，探讨肿瘤多药耐药的发生机制。本课题首先利用阿霉素的自发荧光，分别通过荧光显微镜镜检定性分析和对细胞内亚细胞阿霉素蓄积量进行定量分析。发现阿霉素在野生型细胞MCF7/W中蓄积量较多且主要呈核浓聚，而在阿霉素耐药细胞MCF7/ADM中蓄积量则较少且主要存在于胞浆。再经TOF-MS分析细胞内阿霉素的代谢，发现耐药细胞内阿霉素与野生型细胞内有差异峰，提示阿霉素在耐药细胞中可能经过了一定的修饰作用。作为可以自由进入细胞包括细胞核的脂溶性小分子药物，阿霉素在耐药细胞中却并未切合这一点，因而我们推测在细胞中阿霉素可能被胞浆内的蛋白相结合而截留，或发生了修饰作用被核孔复合物所阻挠，使得阿霉素难以进入细胞核；而胞内阿霉素总蓄积量的较少则可能是细胞膜上P-glycoprotein （P-gp）或胞内囊泡的作用，P-gp或囊泡将进入细胞内的药物带出细胞，从而使胞内阿霉素的含量减少。带着以上的疑问，本课题接来下分别提取MCF7/W和MCF7/ADM细胞的核蛋白，进行转录因子膜分析，选取目前研究较多的P-gp蛋白上游转录因子YB-1和自噬形成的标记蛋白LC-3蛋白的上游转录因子TFEB进行关注，结合Weatern blot分析发现，与野生型细胞相比，耐药细胞内P-gp和LC-3的表达均明显增强。另一方面，γ tocotrienol对耐药的逆转作用分析，P-gp与在细胞内的定位受小G蛋白的影响，而小G蛋白的膜定位依赖于疏水异戊二烯基（FPP&GGPP）与小G蛋白（Rab、Rho）的共价连接。本文利用一段带有特异CaaX末端的荧光片段通过酶作用和FPP&GGPP相结合使FPP&GGPP接上可探测的荧光末端，再通过HPLC检测细胞中FPP&GGPP含量。结果MCF7/W细胞中FPP&GGPP细胞中含量高于MCF7/ADM细胞，而随着作用时间的延长细胞内的FPP&GGPPH含量均下降。提示γ tocotrienol可以通过影响FPP&GGPP的含量，从而影响小G蛋白异戊二烯化程度，进而影响P-gp的定位逆转细胞耐药。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-18
  1.1 研究背景  8-15
    1.1.1 肿瘤的治疗  8
    1.1.2 肿瘤多药耐药的产生及机制  8-12
    1.1.3 阿霉素作为抗肿瘤剂的研究进展  12-13
    1.1.4 γ-生育三烯酚（γ-Tocotrienol）与肿瘤多药耐药的关系  13-15
  1.2 研究基础  15-16
  1.3 课题研究的意义  16
  1.4 课题研究的内容  16-18
第二章阿霉素在 MCF7/W 细胞和 MCF7/ADM 细胞中的定位分析  18-30
  引言  18
  2.1 实验材料、仪器  18-19
    2.1.1 实验材料  18
    2.1.2 实验试剂  18-19
    2.1.3 实验仪器  19
  2.2 实验方法  19-23
    2.2.1 细胞培养液  19-20
    2.2.2 细胞培养  20
    2.2.3 阿霉素对 MCF7/W 和 MCF7/ADM 细胞的 IC50 检测  20
    2.2.4 细胞活力分析  20-21
    2.2.5 细胞镜检：阿霉素自发荧光  21
    2.2.6 细胞对阿霉素的积累量分析  21-22
    2.2.7 亚细胞阿霉素定位分析  22
    2.2.8 细胞内阿霉素的代谢分析  22
    2.2.9 数据分析  22-23
  2.3 实验结果  23-28
    2.3.1 不同浓度阿霉素对 MCF7/W 和 MCF7/ADM 细胞的生长抑制情况  23
    2.3.2 细胞镜检  23-24
    2.3.3 细胞对阿霉素的积累量分析  24
    2.3.4 亚细胞阿霉素定位分析  24-25
    2.3.5 细胞内阿霉素 TOF-MAS 分析  25-28
  2.4 讨论  28-29
  2.5 本章小结  29-30
第三章 MCF7/W 和 MCF7/ADM 细胞内转录因子的差异  30-44
  引言  30-31
  3.1 实验材料、仪器  31
    3.1.1 实验材料  31
    3.1.2 实验试剂  31
    3.1.3 实验仪器  31
  3.2 实验方法  31-38
    3.2.1 细胞培养  31-32
    3.2.2 细胞核蛋白的提取  32
    3.2.3 蛋白含量测定  32-33
    3.2.4 转录因子芯片分析 Protein/DNA array  33-35
    3.2.5 ECL 发光显色  35-36
    3.2.6 细胞内总蛋白的提取  36-37
    3.2.7 SDS-PAGE 电泳试剂的配制  37
    3.2.8 SDS-PAGE 电泳凝胶的配制  37-38
    3.2.9 Western Blot 分析细胞内 P-gp 和 LC3  38
    3.2.10 数据分析  38
  3.3 实验结果  38-41
    3.3.1 核蛋白浓度  38-39
    3.3.2 转录因子芯片分析  39-40
    3.3.3 Western blot 分析细胞内 P-gp 和 LC-3  40-41
  3.4 讨论  41-42
  3.5 本章小结  42-44
第四章维生素 E 类似物γ tocotrienol 对多药耐药的逆转作用  44-52
  引言  44
  4.1 实验材料、仪器  44-45
    4.1.1 实验材料  44
    4.1.2 实验试剂  44-45
    4.1.3 实验仪器  45
  4.2 实验方法  45-47
    4.2.1 细胞培养  45
    4.2.2 GT3 对 MCF7/ADM 细胞的作用及药敏性检测  45-46
    4.2.3 细胞总蛋白的提取  46
    4.2.4 细胞内 P-gp 的 Western blot 分析  46
    4.2.5 细胞内 GGPP&FPP 的提取  46
    4.2.6 酶反应  46
    4.2.7 HPLC 操作  46-47
    4.2.8 数据分析  47
  4.3 实验结果  47-49
    4.3.1 α-toco，σ-T3， GT3 对 MCF7/ADM 细胞 IC50 的影响  47-48
    4.3.2 Western Blot 分析  48
    4.3.3 GT3作用后细胞内的GGPP&FPP含量  48-49
  4.4 讨论  49-51
    4.4.1 GT3 对耐药的逆转作用分析  49-50
    4.4.2 作用机制分析  50-51
  4.5 本章小结  51-52
第五章总结与展望  52-54
  课题总结  52
  展望  52-54
致谢  54-56
参考文献  56-60
硕士阶段已发表论文  60

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