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减毒沙门氏菌运载共表达质粒Stat3-siRNA与Endostatin对小鼠肝细胞原位癌模型的治疗作用及机理探讨

作　者: 贾慧婕
导　师: 李扬; 张灵
学　校: 吉林大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: Stat3 Endostatin 基因治疗肝细胞癌 RNA干扰抗肿瘤免疫
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是一种恶性程度非常高的肿瘤，大约占原发性肝癌的90%以上。目前，手术切除和肝脏移植无疑是HCC最好的治疗手段，但是由于HCC患者早期没有明显的症状，加上恶性程度一般较高及肿瘤在早期往往就有转移，因此，仅仅有10-20%的患者适合做手术切除根治术。另外，HCC的治疗方法还包括系统性化疗、乙醇注射、动脉化疗性栓塞和放射线治疗等，但是这些治疗方法的效果也并不明显，并且还常常伴随着很大的副作用。随着科学的发展，肝细胞癌的治疗已经取得了很大的进展，但是HCC患者的预后依然没有得到太大的改善。因此，探索一种副作用小，并且能够靶向治疗HCC的方法成为了一个亟待解决的问题。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，基因治疗得到了越来越广泛的关注。信号转导子和转录活化子3基因，简称Stat3，是STAT家族中一种被广泛研究的基因。研究证明，Stat3的持续活化会导致肝细胞癌等多种肿瘤的发生。Stat3的持续激活主要通过以下四个机制导致肿瘤的发生：（1）抑制肿瘤细胞凋亡；（2）促进肿瘤细胞增殖；（3）促进肿瘤组织中血管生成；（4）介导肿瘤免疫逃逸。一些相关研究发现，抑制肿瘤细胞中Stat3信号通路可以显著抑制肿瘤的生长和延长肿瘤患者的生存期。因此，抑制Stat3在肝细胞癌中的表达可能成为基因治疗肝细胞癌一个非常理想的分子靶点。从另一个角度看，肝细胞癌是一个富含血管的肿瘤。血管生成在肝细胞癌发生、发展及转移中起着至关重要的作用。因此，抗肿瘤血管生成基因治疗（阻止肿瘤的血液供应）与Stat3基因沉默疗法相结合可能会产生更有效的治疗作用。内源性血管生成抑制剂Endostatin（内皮抑素），是XVIII型胶原C末端的一个20kD的片段，由O’Reilly于1997年从小鼠血管内皮瘤上清中分离和纯化得到。Endostatin是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂，它可以通过抑制肿瘤组织血管内皮细胞增殖等机制抑制肿瘤血管的生成，从而达到抑制肿瘤生长的效果。研究表明，Endostatin在小鼠、大鼠肿瘤模型和肿瘤临床前期实验中都显示出显著的抗血管生成作用。另外，Endostatin不仅毒性非常小，而且没有耐药性。基因治疗载体在肝细胞癌的基因治疗同样至关重要。一个合适的载体应该不仅能够较高的选择性靶向肿瘤及携带真核表达载体在肿瘤细胞中顺利表达靶基因，并且毒性要小。鼠伤寒沙门氏菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，具有成为基因治疗载体的很多优势：它不仅可以选择性在肿瘤组织中定居和扩增（肿瘤组织中的沙门氏菌是正常组织中的1000倍以上），而且可以作为基因转染的工具将真核表达质粒转染到真核细胞中（例如肿瘤细胞），并且对正常组织不会产生很大的毒副作用。近些年来，一些使用基因工程手段改造制成的减毒沙门氏菌菌株，毒力更弱，靶向性更强，被越来越多的做为肿瘤基因治疗的载体。研究证明，应用改造的沙门氏菌菌株携带靶基因（白介素-2、白介素-12和MDR1siRNA等）进行基因治疗，已经取得了良好的治疗效果。我们前期研究已经证明，减毒沙门氏菌携带含有Stat3特异性小干扰RNA质粒对前列腺癌有很好的治疗作用。因此，在本研究中，我们主要观察了减毒沙门氏菌携带含有Stat3特异性小干扰RNA和Endostatin基因的共表达质粒对小鼠肝原位癌模型的治疗效果。目的：观察减毒沙门氏菌携带含有Stat3特异性小干扰RNA和Endostatin基因的共表达质粒对小鼠肝原位癌模型的治疗效果，并进行机制探索。方法：选择小鼠肝癌腹水瘤细胞H22作为建立小鼠肝原位癌移植模型的细胞系。H22肝原位癌移植模型建立成功后，将小鼠随机分成六组： Mock组（注射PBS）、单纯注射沙门氏菌组、pSi-Scramble组（注射沙门氏菌携带pSi-Scramble质粒）、pEndostatin组（注射沙门氏菌携带pEndostatin质粒）、pSi-Stat3组（注射沙门氏菌携带pSi-Stat3质粒）和pEndo-Si-Stat3组（注射沙门氏菌携带共表达质粒pEndo-Si-Stat3）。在肿瘤移植后第十天，通过腹腔注射1×106CFU携带各种重组质粒的减毒沙门氏菌的方法进行基因治疗。通过监测小鼠的全身反应，体重、食欲和毛发等，观察是否有副作用的出现。治疗三周后，将小鼠称重后处死，分离肿瘤组织并称重，同时通过HE染色的方法检测检测肿瘤的组织学变化。随后，应用以下方法对减毒沙门氏菌携带含有Stat3特异性小干扰RNA和endostatin基因的共表达质粒对小鼠肝原位癌模型的作用机制进行初步探索。通过实时定量RCR、Western blotting和ELISA的方法，检测肿瘤组织中靶基因（Stat3和Endostatin）的表达情况。肿瘤细胞增殖和细胞周期分别应用免疫组化（检测增殖标志物PCNA）和流式细胞技术检测细胞周期的实验方法。用Annexin V和TUNEL的方法检测肿瘤细胞凋亡。肿瘤血管生成的检测分别应用免疫组化（检测肿瘤新生血管标志物CD34）、Western blotting和RT-PCR（检测血管内皮生长因子VEGF的表达）的实验方法。肿瘤免疫情况的检测采用免疫组化的方法检测肿瘤中T淋巴细胞浸润（CD4和CD8）的情况。治疗后小鼠整体免疫情况的检测分别应用以下实验方法：分离小鼠的脾脏组织，计算脾指数；通过流式细胞术及NK细胞杀伤实验检测小鼠脾脏中NK细胞的表达及功能；采用流式细胞术检测脾脏中T淋巴细胞及Treg细胞的表达；通过ConA诱导的T淋巴细胞增殖实验检测脾脏中T淋巴细胞的功能；ELISA实验检测小鼠血清中细胞因子TNF-α、TGF-β和IFN-γ的水平。结果：减毒沙门氏菌携带Stat3特异性小干扰RNA与Endostatin共表达质粒治疗小鼠肝细胞原位癌不仅显示出强大的抑瘤效果，而且治疗效果优于单基因治疗。减毒沙门氏菌phoP/phoQ菌株显示出很好的靶向肿瘤的特性，并且没有明显的副作用。Western blotting、RT-PCR和ELISA结果显示，共表达质粒治疗后，Stat3基因表达被干涉，而Endostatin的分泌增强。Annexin V和TUNEL的实验表明，共表达质粒联合治疗能够显著促进肿瘤细胞凋亡。细胞周期检测结果显示，共表达质粒治疗能够显著阻止肿瘤细胞细胞周期进程。免疫组化实验发现，应用pEndo-Si-Stat3治疗能够抑制肿瘤组织中增殖标志物PCNA及新生血管标志物CD34的表达，并且能够增加肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润。T淋巴细胞增殖试验和NK细胞杀伤实验结果发现，联合基因治疗能够增强NK细胞和T淋巴细胞的抗肿瘤活性。流式细胞术结果显示，应用pEndo-Si-Stat3治疗能够增加小鼠脾脏中CD8+T淋巴细胞的表达，降低Treg细胞的表达。ELISA结果显示，小鼠血清中免疫刺激性细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平显著升高；相反，免疫抑制性细胞因子TGF-β的水平则明显降低。综上所述，用Stat3特异性小干扰RNA与Endostatin的联合基因治疗能够明显促进肿瘤细胞凋亡、阻止肿瘤细胞细胞周期进程、抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤组织血管生成，并且能够恢复NK细胞和T淋巴细胞的抗肿瘤免疫功能。结论：减毒沙门氏菌phoP/phoQ菌株携带抑制Stat3的表达和高表达Endostatin的共表达质粒能够显著抑制小鼠肝细胞原位癌的生长，增强小鼠机体的抗肿瘤免疫反应，并且治疗效果优于单基因治疗，有可能为临床上基因治疗肝细胞癌提供一定的帮助。

全文目录

前言  5-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-17
引言  17-19
第1章文献回顾  19-51
  1.1 肝癌的发生发展以及治疗进展  19-33
    1.1.1 肝癌概述  19
    1.1.2 肝癌的病因及发病机制  19-23
    1.1.3 肝癌的信号传导通路  23-28
    1.1.4 肝癌的治疗  28-33
  1.2 细菌作为基因治疗载体的应用现状  33-38
    1.2.1 细菌作为基因治疗载体的应用  34-35
    1.2.2 细菌特异性靶向肿瘤的机制分析  35
    1.2.3 细菌性载体基因转染的机制  35-36
    1.2.4 沙门氏菌作为基因治疗载体的应用  36-37
    1.2.5 沙门氏菌临床前与临床相关研究  37
    1.2.6 沙门氏菌 phoP/phoQ 菌株的应用进展  37-38
  1.3 STAT3 基因功能与应用概述  38-47
    1.3.1 Stat3 的信号转导过程  38-39
    1.3.2 Stat3 促肿瘤发生发展的机制  39-45
    1.3.3 靶向 Stat3 的肿瘤治疗  45-47
  1.4 ENDOTATIN 基因功能与应用概述  47-51
    1.4.1 Endostatin 的生物学功能  47-48
    1.4.2 应用 Endostatin 的肿瘤治疗研究  48-51
第2章材料和方法  51-73
  2.1 实验材料和设备  51-56
    2.1.1 实验材料  51-55
    2.1.2 主要仪器与设备  55-56
  2.2 实验方法  56-73
    2.2.1 肝原位移植瘤模型的建立  56-57
    2.2.2 减毒沙门氏菌携带各个重组质粒治疗  57-58
    2.2.3 铺板法检测菌群分布  58
    2.2.4 肿瘤细胞悬液的制备  58
    2.2.5 肿瘤细胞细胞周期检测  58
    2.2.6 流式细胞术检测肿瘤细胞早期凋亡（Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒）  58-59
    2.2.7 TUNEL 法原位检测肿瘤细胞晚期凋亡  59-60
    2.2.8 RT-PCR 和 real-time RT-PCR 方法检测肿瘤组织中 mRNA 的表达  60-63
    2.2.9 Western blot 方法检测蛋白表达  63-65
    2.2.10 免疫组化原位检测肿瘤组织蛋白的表达  65-66
    2.2.11 小鼠脾细胞悬液制备  66
    2.2.12 流式细胞仪检测脾脏中免疫细胞（NK 和 T 淋巴细胞）的表达水平  66-67
    2.2.13 流式细胞仪检测脾脏中 CD4+CD25+Treg细胞中 Foxp3 的表达水平  67-68
    2.2.14 检测小鼠脾脏指数  68
    2.2.15 ConA 诱导的脾脏 T 淋巴细胞增殖反应能力的测定  68
    2.2.16 NK 细胞杀伤活性的检测  68-69
    2.2.17 ELISA 检测 Endostatin 和细胞因子（IFN-γ、TGF-β1 和 TNF-α）的水平  69-72
    2.2.18 结果处理及统计学分析  72-73
第3章实验结果  73-89
  3.1 减毒沙门氏菌使用剂量的优化和靶向性检测  73-75
    3.1.1 沙门氏菌使用剂量的优化  73-74
    3.1.2 沙门氏菌靶向性检测  74-75
  3.2 联合基因治疗后肿瘤组织中靶基因的表达以及对荷瘤小鼠的影响  75-77
    3.2.1 联合基因治疗对肝原位肿瘤的治疗效果  75-76
    3.2.2 肿瘤组织中靶基因（Stat3 与 Endostatin）的表达情况  76-77
  3.3 联合基因治疗抑瘤作用的机制研究  77-82
    3.3.1 各组肿瘤组织 HE 染色的对比  77-78
    3.3.2 各组肿瘤细胞增殖和凋亡的检测  78-80
    3.3.3 各组肿瘤细胞细胞周期的检测  80
    3.3.4 各组肿瘤组织中新生血管的检测  80-82
  3.4 联合基因治疗对小鼠抗肿瘤免疫的影响  82-89
    3.4.1 各组肿瘤组织中 T 淋巴细胞的浸润  82-83
    3.4.2 各组脾指数分析  83-84
    3.4.3 各组小鼠脾脏中 NK 细胞功能和数量变化  84-85
    3.4.4 各组小鼠脾脏中 T 淋巴细胞的数量变化和细胞活性  85-86
    3.4.5 各组小鼠脾脏中 Treg细胞的数量变化  86-87
    3.4.6 各组小鼠血清中 IFN-γ和 TNF-α的含量  87-88
    3.4.7 各组小鼠血清中 TGF-β的含量  88-89
第4章讨论  89-97
第5章结论  97-99
参考文献  99-125
作者简介及在学期间所取得的科研成果  125-127
致谢  127

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