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淋巴结转移率与乳腺癌预后关系的研究及乳腺浸润性微乳头状癌小RNA特点的初步探讨

作　者: 杨翠翠
导　师: 付丽
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 乳腺癌 淋巴结转移数 淋巴结转移率 HER-2 生存 乳腺浸润性微乳头状癌 高通量测序 MicroRNA 福尔马林固定、石蜡包埋 实时定量PCR
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


第一部分目的探讨淋巴结转移率(lymph node ratio, LNR)是否能更优于淋巴结转移数(positive lymph nodes, PLN)用于评价乳腺癌术后患者的复发风险和总生存时间以及LNR联合人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)表达状态评价乳腺癌预后风险的可行性。方法回顾性分析天津医科大学附属肿瘤医院2002～2005年行腋下淋巴结清扫术且术后经病理证实淋巴结转移阳性、至少有5年完整随访资料的原发性浸润性乳腺癌患者临床病理资料1095例,采用单因素、多因素分析方法,比较分析PLN与LNR对乳腺癌术后患者无复发生存(replase free survival, RFS)、总生存(overall survival, OS)的影响；采用Log-rank检验比较不同LNR分组患者的生存差异,并据此确定LNR的最佳分组界值；分析比较PLN联合HER-2表达状态所界定的风险分组(PLN风险分类)及LNR联合HER-2表达状态所界定的风险分组(LNR风险分类)患者的生存差异。结果1.单因素生存分析,肿瘤大小分期,组织学分级、ER/PR/HER-2状态、PLN、LNR、切检淋巴结总数、结外软组织侵犯、辅助化疗及内分泌治疗与患者RFS、OS均具有明显的相关性(P<0.05)。2.多因素生存分析,当PLN和LNR作为协变量分别进入COX比例风险模型时,PLN和LNR均为患者RFS和OS的独立预测指标(P<0.001)；当PLN和LNR作为协变量同时进入COX比例风险模型时,LNR依然是患者RFS和OS的独立预测指标(RFS:P<0.001, OS:P=0.002),而PLN不再是其独立预测指标(RFS:P=0.792, OS:P=0.124)。3. Log-rank检验结果显示不同LNR分组(≤0.10,0.11～0.30和>0.30)患者其生存时间具有明显的差异,尤以LNR>0.30患者组最为显著。4. Kaplan-Meier分析显示,PLN风险分类所划定的中度、高度危险组其无复发生存率分别为82.0%和57.1%(χ2=66.374,P<0.001),总生存率分别为92.3%和74.2%(χ2=50.139,P<0.001)；LNR风险分类所划定的中度、高度危险组其无复发生存率分别为80.6%和53.5%(χ2=85.117,P<0.001),总生存率分别为91.0%和71.8%(χ2=61.281,P<0.001)。5.如果将中度危险组的复发或死亡风险比率(hazard ratio, HR)设为1的话,那么PLN风险分类所划定的高度危险组调整后的复发HR为2.88(95%置信区间,2.20-3.76)和死亡HR为3.78(95%置信区间,2.54-5.62)；LNR风险分类所划定的高度危险组调整后的复发HR为2.93(95%置信区间,2.31-3.73)和死亡HR为3.57(95%置信区间,2.54-5.02)。结论LNR是乳腺癌患者的独立预后指标,相对于PLN而言,LNR能更好的评价乳腺癌术后患者的复发风险和总生存时间。LNR联合HER-2表达状态所界定的风险分组不亚于PLN联合HER-2表达状态所界定的风险分组。由于LNR能更好地反映患者的腋窝淋巴结状态,因此我们建议采用LNR联合HER-2表达状态来评价淋巴结转移阳性的乳腺癌患者的预后风险,为临床医生制定辅助治疗方案提供更有力的参考依据。第二部分目的浸润性微乳头状癌(invasive micropapillary carcinoma, IMPC)是一种特殊类型的浸润性乳腺癌,因其特殊的生长模式：集团性生长、主间质分离以及高度的淋巴管侵犯、高淋巴结转移等预后不良的生物学行为,越来越受到临床及病理医师的高度重视。近年来研究发现micro-RNA (miRNA)在肿瘤的发生发展过程中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用,为阐明肿瘤的发病机制并对其治疗提供了崭新的思路。本研究旨在从,miRNA表达水平角度探讨IMPC高淋巴管侵犯、高淋巴结转移等不良生物学特性发生的分子机制。方法选取经福尔马林固定、石蜡包埋的纯型IMPC和非特殊型浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma of no special types, IDC-NSTs)组织样本各5例以及新鲜冻存样本各1例进行高通量测序；根据测序结果筛选出差异表达的的miRNA,另外选取22例IMPC和24例IDC-NSTs患者石蜡包埋组织样本,采用实时定量PCR进一步验证测序结果的准确性。结果1.通过对两组样本进行高通量测序,共计获得19%,504，842个序列读数。去除原始数据中的接头序列、低质量标签序列和接头聚合物污染后,共计获得175,300,661(88.76%)个序列读数,序列长度主要集中于21～23个核菅酸大小2.对测序数据整理分析后发现,IMPC和IDC-NSTs两组样本间共存在45种差异表达的miRNA。非监督聚类分析结果显示,由这些差异表达的miRNA所形成的树状图能明显的区分IMPC和IDC-NSTs;来源于两例患者自身配对的石蜡包埋和新鲜冻存样本中,miRNA表达呈现出良好的相关性,Pearson相关系数分别为0.9909(p<0.001)和0.9904(p<0.001)。3.实时定量PCR结果显示,let-7b、miR-30c、miR-148a、miR-181a、miR-181a*和miR-181b在两组样本中的表达水平具有明显的差异,与高通量测序结果一致。4.本组病例miRNA序列存在5’端变异,miRNA编辑和3’端非模板性插入等特点。Drosha酶比Dicer酶能更精确地定义IMPC和IDC-NSTs两组样本中的miRNA5’端；IDC-NSTs患者组miRNA编辑要明显多于IMPC患者组(p<0.05),胞嘧啶转变为胸腺嘧啶(C-to-T)和腺嘌呤转变为鸟嘌呤(A-to-G)分别占miRNA编辑总数的36.4%-44.0%和8.8%-11.4%；就成熟体miRNA编辑的空间定位而言,5、7、8和13～16位核苷酸出现miRNA编辑的频率相对较低；7.4%的miRNA存在3’末端核苷酸的插入,并且绝大部分为腺嘌呤核苷酸(约占58.9%)和尿嘧啶核苷酸(约占33.6%)插入结论1.高通量测序发现IMPC和IDC-NSTs之间存在差异表达miRNA,这些miRNA的聚类分析可以区分IMPC和IDC-NSTs.2.相对于IDC-NSTs而言，let-7b、miR-30c、miR-148a、miR-181a、miR-181a*和miR-181b在IMPC中的低表达可能是造成IMPC高淋巴管侵犯、高淋巴结转移的原因之一。3. IMPC和IDC-NSTs某些miRNA序列存在5’端变异,：miRNA编辑和3’端非模板性插入等现象,但这并非IMPC所特有的影响其高淋巴管侵犯、高淋巴结转移等不良生物学行为的关键因素。4.高通量测序所揭示的乳腺IMPC小RNA特点使我们对IMPC高侵袭性发生的的分子机制有了更加深入的了解。

全文目录


中文摘要  4-8
Abstract  8-14
缩略语/符号说明  14-15
前言  15-18
  第一部分  15-16
    研究现状、成果  15
    研究目的、方法  15-16
  第二部分  16-18
一、淋巴结转移率与乳腺癌预后关系的研究  18-28
  1.1 对象和方法  18-19
    1.1.1 临床病例资料  18
    1.1.2 随访  18
    1.1.3 统计学处理  18-19
  1.2 结果  19-25
    1.2.1 临床病理特征及淋巴结状态分布情况  19
    1.2.2 单因素生存分析  19
    1.2.3 多因素生存分析  19-22
    1.2.4 Log-rank检验比较不同LNR分组患者的生存差异  22-23
    1.2.5 Kaplan-Meier法绘制不同风险分组患者的生存曲线  23
    1.2.6 不同风险分组的单因素回归分析  23-25
  1.3 讨论  25-27
  1.4 小结  27-28
二、乳腺浸润性微乳头状癌小RNA特点的初步探讨  28-61
  2.1 对象和方法  28-41
    2.1.1 实验材料  28-29
    2.1.2 免疫组化法检测IMPC样本EMA表达  29-31
    2.1.3 RNA提取及质量检测  31-35
    2.1.4 小RNA文库制备和测序  35-36
    2.1.5 实时定量PCR验证高通量测序结果  36-40
    2.1.6 实验数据的生物信息学及统计学处理  40-41
  2.2 结果  41-57
    2.2.1 5例IMPC和5例IDC-NSTs小RNA转录本的高通量测序  41
    2.2.2 文库构成及序列注释、映射定位结果  41-42
    2.2.3 无偏分析IMPC和IDC-NSTs差异表达的成熟miRNA  42-49
    2.2.4 实时定量PCR验证miRNA表达谱  49
    2.2.5 miRNA异构体分析  49-53
    2.2.6 分析成熟体miRNA的编辑  53-55
    2.2.7 分析miRNA3’末端核苷酸的插入  55-57
  2.3 讨论  57-59
  2.4 小结  59-61
结论  61-62
参考文献  62-68
发表论文和参加科研情况说明  68-69
综述 淋巴结转移率与乳腺癌预后关系的研究进展  69-79
  综述参考文献  75-79
致谢  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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