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脊髓缺血/再灌注损伤上调蛋白α-tubulin、NF-M和NF-L鉴定与功能分析

作 者: 王海涛
导 师: 杨小玉
学 校: 吉林大学
专 业: 外科学
关键词: α-微管蛋白 神经丝蛋白 缺血/再灌注 蛋白质组学 免疫组化 免疫印迹
分类号: R651.2
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


进一步研究脊髓缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion;I/R)损伤过程中与神经再生相关上调蛋白变化特点及其作用机制,从而为寻找脊髓I/R损伤特异性诊断/治疗新靶点奠定坚实基础。本文以急性脊髓I/R损伤兔模型为研究对象,并以其损伤节段腰髓为研究对象,应用差异蛋白组学双向电泳(DIGE)分析比较再灌注0、12、24、48h时间点脊髓蛋白表达变化,成功获得各个时间点的差异蛋白,整合应用免疫组化免疫印迹分析方法对筛选出特异上调2倍以上的神经类蛋白质及其磷酸化修饰蛋白进行鉴定及功能分析。研究结果表明:在各损伤时间点脊髓组织中α-微管蛋白(α-tubulin)、神经丝蛋白-M(NF-M)和神经丝蛋白-L(NF-L)分别定位于神经元细胞膜、轴突及细胞浆中;其中在脊髓灰质、白质及前后角分布中,脊髓灰质较白质表达量增加(P<0.05);脊髓前角和后角区域表达量未见明显差异(P>0.05)。发现三种蛋白表达量随脊髓再灌注时限的延长具有依从性递增,而在脊髓再灌注24h达到峰值,后逐渐回归至脊髓再灌注初始水平,前期实验我们发现NF-M、NF-L可能发生了磷酸化修钸,其磷酸化蛋白与未磷酸化NF-M、NF-L蛋白表达量变化呈平行关系。结论:α-tubulin、NF-M和NF-L蛋白对损伤脊髓神经元具有保护和修复作用,其作用机制可能是通过修复神经元细胞膜、促进轴突再生途径参与脊髓I/R损伤的保护,NF-M和NF-L蛋白对I/R损伤脊髓保护作用我们推测可能是通过其蛋白磷酸化修饰来实现。本论文的贡献:我们应用蛋白质组学整合免疫组化、免疫印迹分析方法对脊髓I/R损伤过程中2倍以上上调蛋白进行了鉴定与功能分析。创新性从蛋白质水平提出了上调蛋白α-tubulin、NF-M和NF-L参与脊髓I/R损伤病理演变全过程,对脊髓损伤具有重要保护和修复作用,其保护机制可能是通过修复神经元细胞膜、促进轴突再生实现,其中NF-M和NF-L蛋白参与脊髓I/R损伤保护是通过其蛋白磷酸化修饰来实现的。本实验的研究结果将为纵深阐述脊髓I/R损伤过程中保护作用新机制提供重要的科学证据,国内外未见相关报道。本论文获得国家自然科学基金的资助(批准号:30872609/H605)。

全文目录


提要  4-5
英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-15
第1篇 文献综述  15-36
  第1章 神经丝蛋白的功能研究进展  15-23
    第1节 神经丝蛋白的研究现状  15-19
    第2节 NF 转录后调控的研究进展  19-23
  第2章 微管蛋白在神经系统的功能研究  23-27
    第1节 微管蛋白的一般功能研究  23-24
    第2节 微管蛋白修饰在神经系统功能研究  24-27
  参考文献  27-36
第2篇 前言  36-38
第3篇 研究思路与技术路线  38-41
第4篇 急性脊髓 I/R 损伤相关实验研究  41-93
  第1章 急性 I/R 兔脊髓损伤模型建立  41-51
    第1节 材料  41
    第2节 方法  41-45
    第3节 结果  45-48
    第4节 讨论  48-50
    第5节 结论  50-51
  第2章 急性脊髓 I/R 损伤蛋白质组学研究  51-66
    第1节 材料  51-53
    第2节 方法  53-56
    第3节 结果  56-60
    第4节 讨论  60-65
    第5节 结论  65-66
  第3章 脊髓 I/R 上调蛋白免疫组化分析  66-75
    第1节 材料  66
    第2节 方法  66-68
    第3节 结果  68-71
    第4节 讨论  71-74
    第5节 结论  74-75
  第4章 脊髓 I/R 上调蛋白免疫印迹实验分析  75-89
    第1节 材料  75-79
    第2节 方法  79-81
    第3节 结果  81-86
    第4节 讨论  86-88
    第5节 结论  88-89
  第5章 脊髓 I/R 损伤 WB、IHC 与 DIGE 研究的综合讨论  89-93
第5篇 结论  93-95
参考文献  95-98
作者简介及在学期间所取得的科研成果  98-99
致谢  99

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