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炎症反应及PKA/CREB信号途径介导帕瑞昔布脑保护机制的探讨

作　者: 王娜
导　师: 郭曲练
学　校: 中南大学
专　业: 麻醉学
关键词: 帕瑞昔布脑缺血神经保护 TNF-α HMGB1 炎症 CREB BDNF 自噬 Beclin1
分类号: R614
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑缺血一定时间恢复血液供应后,其功能不但未能恢复,却出现了更加严重的脑机能障碍,称之为脑缺血/再灌注(Ischemic-reperfusion,I/R)损伤。临床麻醉中颈动脉瘤手术、颅内动脉瘤切除术、心肺复苏过程中均不可避免地发生脑缺血再灌注损伤,影响了患者术后预后,这引起了麻醉工作者的重视,如何防治脑缺血再灌注损伤已成为科研的重要内容之一。环氧化酶(Cyclcoxygenase, COX),又称前列腺素内过氧化物合成酶,是前列腺素(Prostaglandin, PG)合成过程中一个重要限速酶,催化花生四烯酸经由PGG2转化成PGH2。 COX分为结构型(COX-1)和诱导型(COX-2)。COX-1被认为是“看家基因”,在大多数正常组织中的表达稳定；而COX-2被认为是“快速反应基因”,静息时不表达,仅在细胞受到刺激时迅速合成,细菌脂多糖、生长因子、促炎细胞因子、促肿瘤剂可促进COX-2表达增加。基于此人们推测COX-2是在炎症和其他病理情况中的主要存在形式。大量研究表明COX-2在缺血性脑损伤中至关重要。在离体实验以及不同脑缺血、脑出血、脑外伤实验模型中,抑制COX-2可以起到一定的神经保护保护作用。尽管2004年9月Merck公司自愿召回因长期慢性服用导致严重心血管事件的罗非考昔(商品名：万络),但是抑制缺血性神经元表达COX-2、 COX-2下游损伤因子仍然是令人感兴趣的研究方向。诸多动物实验都证实短期给予COX-2抑制剂并不加重脑损伤,但是真正应用于临床时,临床医师还是有所顾虑的。相对于其它COX-2抑制剂,临床上更易接受帕瑞昔布。帕瑞昔布(商品名：特耐)是第二代COX-2抑制剂,是唯一可以经静脉注射或肌内注射的高选择性COX-2抑制剂,现用于术后疼痛的短期治疗,不良反应少。目前研究发现帕瑞昔布能减轻心肌缺血性损伤,抑制心肌细胞死亡,改善心脏功能。但帕瑞昔布介导的脑保护机制目前仍不清楚,值得我们深入研究。越来越多的研究证据表明神经炎症在脑缺血损伤进展中发挥着举足轻重的作用。由于磷脂酶的协调作用,缺血后的膜磷脂释放大量游离的花生四烯酸,经由COX的花生四烯酸代谢途径在脑血管闭塞后的神经炎症中发挥着积极作用,是各种形式脑损伤包括脑缺血中触发和促进炎症进展的重要成分。人们已经在心肌缺血再灌注模型中发现抑制高迁移率族蛋白1(High mobility group box1protein, HMGB1)表达可以有效发挥心肌保护作用,我们推测抑制炎症介质HMGB1表达有可能介导帕瑞昔布的神经保护机制。蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CREB)信号转导途径是重要的神经保护机制之一,在神经发育、神经再生、记忆功能、突触可塑性及细胞修复中发挥着中枢性作用。自噬性程序性细胞死亡即Ⅱ型程序性细胞死亡,不同于细胞凋亡,吸引了越来越多研究人员的关注。在缺血、炎症等应激状态下,自噬可以被激活且与细胞死亡密切相关。研究发现Beclin1在心肌缺血再灌注阶段的自噬现象中发挥着重要的作用。因此,本课题选用远端大脑中动脉永久性阻断后再阻断双侧颈总动脉60min的缺血再灌注模型,于缺血前15min、缺血后12h经阴茎背静脉注射帕瑞昔布,探讨炎症反应、PKA/CREB、自噬是否参与了其神经保护作用。本课题首先通过评估再灌注后大鼠神经功能缺陷评分、脑梗死体积百分比,观察不同剂量的帕瑞昔布是否对Sprague-Dawley大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用；其次,第二部分通过评估再灌注后大鼠神经功能缺陷评分、脑梗死体积百分比、缺血侧大脑皮层神经元HE染色及Niss1染色形态学变化、缺血半影区炎症介质TNF-α、HMGB1表达,提示帕瑞昔布可能通过抑制炎症反应及炎症介质表达而发挥有效的神经保护作用；随后,第三部分给予特异性PKA抑制剂,观察再灌注后大鼠神经功能缺陷评分、脑梗死体积百分比、缺血半影区p-CREB及脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达,探讨帕瑞昔布介导的脑保护效应可能是激活PKA/CREB途径,增加p-CREB、BDNF的表达所致；最后,第四部分给予自噬抑制剂,观察再灌注后大鼠神经功能缺陷评分、脑梗死体积百分比、缺血侧大脑皮层神经元Nissl染色、缺血半影区Beclin1表达,推测帕瑞昔布可能通过抑制自噬Beclin1表达而减少神经细胞死亡,减轻脑缺血再灌注损伤。本课题研究结果证实：(1)静脉注射不同剂量的帕瑞昔布均能明显促进脑缺血后神经功能恢复,减小脑梗死体积,产生显著的神经保护作用。但未证实帕瑞昔布在本模型中的神经保护作用呈剂量依赖性；(2)帕瑞昔布可能通过抑制炎症反应及炎症介质表达,减少缺血再灌注所致的神经元死亡,发挥显著的神经保护作用；(3)帕瑞昔布可能通过激活PKA/CREB途径,增加p-CREB的表达,进而上调BDNF表达,减轻脑缺血再灌注损伤,发挥神经保护作用；(4)帕瑞昔布可能通过抑制自噬Beclin1表达,促进神经功能恢复,减少脑缺血再灌注造成的神经元死亡,发挥一定的神经保护作用。总之,脑缺血及再灌注所致的神经元损伤是一系列极为复杂的病理生理过程,而帕瑞昔布介导的神经保护机制也是一个多分子参与的多信号通路交织的复杂级联反应。第一章不同剂量帕瑞昔布对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用目的：观察静脉注射帕瑞昔布4mg/kg或20mg/kg是否能发挥脑保护效应。方法：健康雄性SD大鼠,体重300-350g,随机分为四组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、帕瑞昔布1组(Parecoxib1)、帕瑞昔布2组(Parecoxib2)。电凝左侧大脑中动脉永久性阻断(Permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)后再阻断双侧颈总动脉60min,缺血前15min、缺血后12h经阴茎背静脉注射帕瑞昔布4mg/kg或20mg/kg。Sham组与I/R组注射等容积的生理盐水。各组于麻醉5min、大脑中动脉永久性阻断15min及再灌注15min时分别记录平均动脉压、心率、体温,并抽动脉血行血气分析。再灌注1d、3d、7d时评估神经功能缺陷评分,再灌注3d时2,3,5一三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)法测定大鼠脑梗死体积百分比。结果：各组pH值、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧分压(Pa02)、平均动脉压(MAP)及体温(T)差异无统计学意义(P>0.05)；与I/R组相比,再灌注1d、3d、7d时神经功能缺陷评分显示Parecoxib1组和Parecoxib2组均能明显改善神经功能(P<0.05),但两组之间比较无统计学差异(P>0.05)；与I/R组相比,再灌注3d时TTC染色显示Parecoxib1组和Parecoxib2组均能明显减少脑梗死体积百分比(P<0.05),但两组之间比较无统计学差异(P>0.05)。结论：静脉注射不同剂量的帕瑞昔布均能明显促进脑缺血后神经功能恢复,减小脑梗死体积,产生显著的神经保护作用。但未证实帕瑞昔布在本模型中的神经保护作用呈剂量依赖性。第二章帕瑞昔布对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响目的：观察帕瑞昔布对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血半影区炎症介质TNF-α、HMGB-1表达的影响。方法：健康雄性SD大鼠,体重300-350g,随机分为三组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、帕瑞昔布组(Parecoxib)。缺血再灌注模型为pMCAO并阻断双侧颈总动脉60min,缺血前15min、缺血后12h经阴茎背静脉注射帕瑞昔布4mg/kg。Sham组与I/R组注射等容积的生理盐水。再灌注1d、3d、7d时评估神经功能缺陷评分、缺血侧大脑皮层神经元HE染色及Niss1染色形态学变化、缺血半影区炎症介质TNF-α、 HMGB1表达；再灌注3d时TTC法测定大鼠脑梗死体积百分比。结果：与I/R组相比,再灌注1d、3d、7d时,帕瑞昔布能明显改善神经功能、减少TNF-a阳性细胞及HMGB1的表达(P<0.05)；再灌注3d时,与I/R组相比,Parecoxib组能明显减少脑梗死体积百分比(P<0.05)。结论：帕瑞昔布可能通过抑制炎症反应及炎症介质表达,减少缺血再灌注所致的神经元死亡,发挥显著的神经保护作用。第三章PKA/CREB信号途径在帕瑞昔布脑保护效应中的作用目的：探讨PKA/CREB信号途径在帕瑞昔布脑保护效应中的作用。方法：健康雄性SD大鼠,体重300-350g,随机分为五组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、帕瑞昔布组(Parecoxib)、帕瑞昔布+H-89组(Parecoxib+H-89)、H-89组(H-89)。缺血再灌注模型为pMCAO并阻断双侧颈总动脉60min,缺血前30min腹腔注射PKA抑制剂H-89,缺血前15min、缺血后12h经阴茎背静脉注射帕瑞昔布4mg/kg。再灌注1d、3d、7d时观察神经功能缺陷评分、缺血半影区p-CREB及BDNF的表达；再灌注3d时TTC法测定大鼠脑梗死体积百分比。结果：与I/R组相比,再灌注1d、3d、7d时,帕瑞昔布能明显改善神经功能、增加p-CREB及BDNF的表达(P<0.05)；再灌注3d时,与I/R组相比,Parecoxib组能明显减少脑梗死体积百分比(P<0.05)；PKA抑制剂H-89能拮抗帕瑞昔布的脑保护效应(P<0.05)。结论：帕瑞昔布可能通过激活PKA/CREB途径,增加p-CREB的表达,进而上调BDNF表达,减轻脑缺血再灌注损伤,发挥神经保护作用。第四章帕瑞昔布对脑缺血再灌注损伤自噬的影响目的：观察帕瑞昔布对大鼠脑缺血再灌注损伤后白噬的影响。方法：健康雄性SD大鼠,体重300～350g,随机分为四组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、帕瑞昔布组(Parecoxib)、3-甲基腺嘌呤组(3-MA)。缺血再灌注模型为pMCAO并阻断双侧颈总动脉60min,缺血前15min、缺血后12h经阴茎背静脉注射帕瑞昔布4mg/kg,3-MA组于缺血前15min侧脑室给予自噬抑制剂3-MA600nmol。再灌注1d、3d、7d时观察大鼠神经功能缺陷评分、缺血侧大脑皮层神经元Nissl染色、缺血半影区Beclinl表达；再灌注3d时TTC法测定大鼠脑梗死体积百分比。结果：与I/R组相比,再灌注1d、3d、7d时,帕瑞昔布、3-MA均能明显改善神经功能、增加存活神经元、减少Beclinl表达(P<0.05)；再灌注3d时,与I/R组相比,Parecoxib组、3-MA组均能明显减少脑梗死体积百分比(P<0.05)。结论：帕瑞昔布可能通过抑制自噬Beclinl表达,促进神经功能恢复,减少脑缺血再灌注造成的神经元死亡,发挥一定的神经保护作用。

全文目录

摘要  4-9
ABSTRACT  9-15
中英文对照说明  15-16
第一章不同剂量帕瑞昔布对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用  16-24
  1 前言  16-17
  2 实验材料与方法  17-19
    2.1 实验材料  17
    2.2 实验方法  17-18
    2.3 统计学分析  18-19
  3 结果  19-21
    3.1 生理参数  19
    3.2 神经功能缺陷评分  19-20
    3.3 脑梗死灶的观察及梗死体积测定  20-21
  4 讨论  21-23
  5 结论  23-24
第二章帕瑞昔布对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响  24-40
  1 前言  24-25
  2 实验材料与方法  25-30
    2.1 实验材料  25-26
    2.2 实验方法  26-28
    2.3 TNF-α的免疫组化分析  28
    2.4 Western Blot检测HMGB1的表达  28-30
    2.5 统计学分析  30
  3 结果  30-37
    3.1 生理参数  30-31
    3.2 神经功能缺陷评分  31
    3.3 脑梗死灶的观察及梗死容积测定  31-32
    3.4 HE染色  32-33
    3.5 Niss1染色  33-34
    3.6 TNF-α免疫组化结果  34-36
    3.7 HMGB1蛋白表达结果  36-37
  4 讨论  37-39
  5 结论  39-40
第三章 PKA/CREB信号途径在帕瑞昔布脑保护效应中的作用  40-54
  1 前言  40-41
  2 实验材料与方法  41-46
    2.1 实验材料  41-42
    2.2 实验方法  42-44
    2.3 Western Blot检测CREB及BDNF的表达  44-45
    2.4 统计学分析  45-46
  3 结果  46-51
    3.1 生理参数  46
    3.2 神经功能缺陷评分  46-47
    3.3 脑梗死灶的观察及梗死容积测定  47-48
    3.4 p-CREB蛋白表达结果  48-50
    3.5 BDNF蛋白表达结果  50-51
  4 讨论  51-53
  5 结论  53-54
第四章帕瑞昔布对脑缺血再灌注损伤自噬的影响  54-68
  1 前言  54-55
  2 实验材料与方法  55-60
    2.1 实验材料  55-56
    2.2 实验方法  56-58
    2.3 Westeen Blot检测Beclin1的表达  58-60
    2.4 统计学分析  60
  3 结果  60-65
    3.1 生理参数  60-61
    3.2 神经功能缺陷评分  61
    3.3 脑梗死灶的观察及梗死体积测定  61-62
    3.4 Niss1染色  62-63
    3.5 Beclin1蛋白表达结果  63-65
  4 讨论  65-67
  5 结论  67-68
结论  68-69
参考文献  69-81
综述  81-104
  参考文献  93-104
致谢  104-105
攻读学位期间主要研究成果  105

炎症反应及PKA/CREB信号途径介导帕瑞昔布脑保护机制的探讨

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