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在α地中海贫血伴智力低下综合征家系中鉴定一种ATRX基因新突变

作　者: 李哲涛
导　师: 徐湘民
学　校: 南方医科大学
专　业: 医学遗传学
关键词: ATR-X综合征 ATRX基因 HbH包涵体外显子测序
分类号: R556.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景与目的α地中海贫血伴智力低下综合征,又称ATR-X综合征(X-linked alpha thalassemia mental retardation syndrome, MIM#301040)是一种罕见的X连锁的显性遗传复杂性的综合征,其临床特征主要包括：智力发育障碍,生长发育迟缓,特征性面容,伴有轻度a-地中海贫血,该病在男性患者的发病率小于<1-9/100,000。致病基因定位于Xq21.1,为编码2492个氨基酸的ATRX基因,到目前为止,全世界已有125种该基因的突变报道,这些突变主要集中位于ATRX氮端的PHD锌指结构域和碳端的螺旋霉结构域中。此外,ATRX还与HP1alpha (heterochromatin protein1alpha), DAXX, MEPC2, and promyelocytic leukemia PML) nuclear bodies等多种蛋白相互作用,ATRX基因的异常,还涉及到以下综合征：Juberg-Marsidi综合征(OMIM#309590), Smith-Fineman-Myers综合征(OMIM#309580), Carpenter-Waziri综合征,严重智力低下伴痉挛性麻痹以及Holmes-Gang综合征。这些研究结果都暗示了ATRX基因的突变,可以引起广泛的临床表型,然而目前对于ATRX基因型和表型的关系没有准确的定义,临床上的很多现象很难去解释。本文研究一个ATR-X综合征家系,对家系中患者进行详细的临床诊断及全面的分子遗传学机制研究,并期发现新的基因或新突变。材料与方法1.材料：临床收集到一个ATR-X综合征家系,病人是两个兄弟来自于一个健康的、非近亲通婚的家族。父母的第一个孩子足月产,6岁死于肝癌,这对夫妇的第二、第四、第五胎小孩均不明原因流产。并对家系人员询问病史,进行全面系统的临床诊断及辅助检查。两兄弟具有如下共同临床特征：(1)生长发育迟缓；(2)智力低下,智力(IQ)检测为25分以下；(3)语言表达严重障碍；语言理解能力差；(4)痴呆面容,反应迟钝,经常发笑和叫喊,注意力不集中；(5)肌张力减退,四肢感觉神经敏感性减低；经常被无意中碰伤和冻伤；(6)不能独立站立和行走,搀扶站立时脚尖着地,生活不能自理；(7)牙齿发育不良,经常流涎；(8)大小便失禁。辅助检查结果：(1)核型分析,46,XY；(2)头部CT提示轻度脑萎缩；(3)血红蛋白HbH包涵体实验阳性,两兄弟包涵体含量分别为6%和7%。弟弟听性脑干反应(ABR)检查提示神经传导障碍。2.方法：签订知情同意书后,绘制家系图,采集了家系中所有成员静脉血并提取了DNA。(1)对两名患者进行全基因组外显子测序。a.将DNA随机打断成100-200bp的片段；b.使用Illumina Paired-End Genomic DNA Sample Prep试剂盒按照说明,并通过Hiseq2000进行测序；c.结果通过SAMtools软件进行过滤；d.参照dbSNP131,1000Genome Project (20100804release)和YH database公共数据库过滤掉已发表的正常对照个体的突变；e.对两名患者的突变集合中取交集。优先在ATRX基因寻找是否存在突变。(2)对患者及父母进行了全基因组拷贝数的分析,使用Array-CGH的方法。(3)对外显子测序发现的突变位点,在其两端设计引物进行PCR扩展后,通过sanger测序的方法在家系中进行验证。(4)之后在更大范围的正常人群中用DHPLC的方法进一步验证。(5)利用I-TASSER软件进行同源建模,以观察突变位点对结构的影响。结果与讨论全面系统的临床分析可以确诊两患者为ATR-X综合征。(1)外显子测序结果经过滤后,平均检测出了非同义／剪切位点／缺失和插入突变共45470个,经公共数据库过滤后剩下412个非同义/剪切位点/缺失和插入突变,接着对两集合取交集,由于首先考虑该家系为X连锁的隐性遗传,我们又在交集中进一步过滤掉了常染色体及Y染色体上的SNPs,最终候选的位点剩下84个；(2)我们优先挑选了ATRX基因上的突变进行验证,因为该基因为已报道的ATR-X综合征的致病基因。外显子测序结果显示在ATRX基因编码区内有c.3773T>A的突变；(3)经过PCR扩增测序验证发现该突变同时存在于两患者中,遗传自母亲。突变c.3772T>A导致谷氨酸替代了结氨酸(V1258E),该位点在多个物种中显示高度的保守性。随后在200个正常人样本中的验证并没有发现有这种突变。(4)使用I-TASSER生物软件模拟突变前后的变化,结果显示由于谷氨酸的替代,使得此区域的电荷和极性发生了改变,从而影响了与该区域作用的DAXX蛋白绑定位点特异性发生了改变。(5)Array-CGH在全基因组下并没有扫描到与智力低下有关拷贝数的变异。通过对患病两兄弟进行了全面系统的诊断及辅助检查,检测出患者具有严重的智力功能障碍,生长发育迟缓,肌张力减退及特征性面容,辅助检查血红蛋白HbH包涵体实验阳性的结果也进一步支持了诊断,接着通过翻阅文献对比临床特征之后,我们确定两患者为α-地中海贫血伴智力低下综合征患者。ATRX基因作为该综合征的候选基因,其位于X染色体上,包含的两个功能区域主要涉及到DNA的重塑、修复及转录的调节。这样的功能主要体现在基因组的一些大的重复序列上,比如核糖体DNA、异染色质和端粒。在许多种类的动物实验中,ATRX基因的异常所表达出了各式各样的表现,像骨骼肌肉的异常和各种肿瘤的发生等等。本次研究所收集到的家系两个患者均表现出了典型的ATR-X综合征的临床表型,同时也存在着个体的差异,弟弟的脸部特征要略轻于哥哥,并伴有神经性耳聋这个哥哥没有的临床表型。目前对于这类疾病基因型和表型的关系研究还很局限,像这种同一突变下的表型差异也是很多报道,大多猜测集中在环境因素,伴随其他的基因突变和表观遗传因子等因素调节。然而最近针对ATR-X综合征中α-地中海贫血程度的一些研究表明,ATRX.基因作用在大量的重复序列上影响的基因的表达,即在同一突变下ATRX基因所作用的重复序列越长,其与重复序列相关的基因的表达量越低,表型也就越重。这样的结果虽然没有直接的去解释两患者的表型差异,但是也从一个侧面去证明了这种现象存在的可能于重复序列的长短变化有关。目前为止,ATRX基因报道了123个不同的突变,主要集中在前后两端的功能区。而我们所发现的突变,位于第10号外显子而非主要报道的功能区上,但此区域包含一个与DAXX相互作用的亚基。随后用I-TASSER进行同源建模分析了突变前后结构的变化,结构发现突变位点位于高保守性的区域,由于氨基酸的替换改变了DAXX亚基绑定位点的特异性,从而影响了ATRX-DAXX复合体的形成。而该复合体主要与染色质重塑有关,ATRX作用在重复序列上抑制着相关基因的表达,当通过与DAXX相互作用使得组蛋白H3.3的聚集,从而达到染色体的重塑,重新激活基因的表达。本研究通过外显子测序发现该位点的突变(c.3773T>A),软件模拟突变影响了ATRX-DAXX复合体的形成,从而导致了疾病的发生,丰富了ATRX基因突变的数据库。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
第一章引言  14-18
第二章材料与方法  18-37
  2.1 研究对象和方法  18-19
  2.2 家系病例研究  19-21
  2.3 血红蛋白HbH包涵体实验  21
  2.4 细胞遗传学分析  21-24
  2.5 细胞基因组DNA提取与保存  24-26
  2.6 基因拷贝数分析—微阵列比较基因组杂交(Array-CGH)  26-27
  2.7 全基因组外显子测序  27-31
  2.8 Sanger测序验证  31-33
  2.9 DHPLC在200个正常样本中对照检测  33-34
  2.10 蛋白结构预测  34-37
第三章结果  37-64
  3.1 调查和研究结果及分析  37-44
  3.2 实验室检查  44-54
  3.3 分子遗传学检测  54-64
第四章讨论  64-76
  4.1 患者的临床特征及其病因学分析  64-68
  4.2 无症状携带者的原因分析  68-69
  4.3 下一步工作计划  69-76
第五章结论  76-77
参考文献  77-81
中英文对照缩略词表  81-84
成果  84-85
致谢  85-87

在α地中海贫血伴智力低下综合征家系中鉴定一种ATRX基因新突变

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