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六价铬间接竞争ELISA检测试剂盒的研制及新型一步法竞争ELISA的建立

作　者: 邹军辉
导　师: 唐勇; 向军俭
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 环境水样 六价铬 单克隆抗体 ELISA试剂盒 直接竞争ELISA
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：以抗Cr3+-EDTA的单克隆抗体为基础，优化建立间接竞争ELISA方法和样品前处理方法，研制适用于环境水样中Cr6+检测的ELISA试剂盒；建立基于酶标记抗体或抗原复合物的更为敏感、简便的直接竞争ELISA方法，用于水样中Cr6+的快速检测。方法：分别配制不同pH及不同离子强度的PBS保温液，优化筛选ELSIA的最佳反应pH值与离子强度。前处理过程中，通过使用纳米二氧化钛（TiO2）吸附去除水样原有Cr3+；优化各项还原条件使Cr6+还原为Cr3+，调节pH进行ELISA检测，通过检测出的Cr3+的量计算原有Cr6+的含量。在此基础上，对所组装试剂盒的检测限、定量限、临界值、准确度和精密度等参数进行综合评价。分别利用胶体金颗粒和过碘酸钠法，将抗原或抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，制备酶标记抗原或抗体复合物，以这些酶结合物为基础初步建立直接竞争ELISA方法。结果：优化了间接竞争ELISA方法的反应条件，研制出用于Cr6+检测的间接竞争ELISA试剂盒，其灵敏度（IC50）为6.2ng/mL、线性范围为1-80ng/mL、检测限（LOD）为0.95ng/mL、定量限为4.68ng/mL、保存期为1年、与其它重金属离子间的交叉反应率均小于1%、变异系数小于12%。前处理方法中，在pH9.0条件下，TiO2能有效分离Cr3+和Cr6+；当还原剂为60mg/L NaHSO3，还原pH为3，反应时间为15min时样品前处理效率最高。实际水样检测结果得到ELISA和ICP-AES两种方法的相关系数达0.9887。利用不同的酶标记复合物，初步建立了5种直接竞争ELISA方法，其IC50从2.74ng/mL到6.4ng/mL，加标回收率范围为88.8%-109.8%，与AAS检测结果数据的相关系数（R2）均大于0.96。结论：研制出适用于环境水样中Cr6+检测的间接竞争ELISA试剂盒，其特异性好、稳定可靠，具有良好的重复性和精密度，可用于环境水样的监测和普查。初步建立并探索了操作简单、结果可靠和灵敏度高的新型直接竞争ELISA方法。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
第一章 前言  8-18
  1. 重金属检测方法的研究进展  9-13
    1.1 传统的仪器法  9
    1.2 化学及传感器法  9
    1.3 免疫学检测法  9-13
  2. 环境水样中重金属检测的样品前处理方法  13-14
  3. 铬的理化性质及生物学活性  14-15
  4. 国内外研究进展  15-16
  5. 本研究的目的和意义  16-17
  6. 技术路线图  17-18
第二章 六价铬 ELISA 检测试剂盒的研制  18-42
  1. 材料与方法  18-20
    1.1 主要试剂和仪器设备  18-19
    1.2 主要溶液的配制方法  19-20
  2. 实验方法  20-27
    2.1 铬单克隆抗体细胞株的复苏及抗体纯化  20-23
    2.2 间接竞争 ELISA 方法的建立  23-24
    2.3 样品前处理方法的研究  24-25
    2.4 Cr~(6+)ELISA 检测试剂盒质量综合评价  25-27
  3. 实验结果  27-40
    3.1 Cr~(3+)单克隆抗体的制备  27
    3.2 六价铬间接竞争 ELISA 检测方法的建立  27-30
    3.3 纳米 TiO_2分离 Cr~(6+)和 Cr~(3+)的条件  30-32
    3.4 Cr~(6+)还原成 Cr~(3+)的条件  32-34
    3.5 ELISA 试剂盒质量综合评价  34-40
  4 讨论  40-42
    4.1 单克隆抗体细胞株的复苏  40
    4.2 样品前处理方法  40-41
    4.3 ELISA 试剂盒的研制  41-42
第三章 一步法竞争 ELISA 的建立  42-59
  1 材料与方法  42-43
    1.1 主要试剂和仪器设备  42
    1.2 主要溶液的配制方法  42-43
  2. 实验方法  43-48
    2.1 纳米金颗粒（AuNP）的制备  43
    2.2 基于酶标记单克隆抗体的竞争 ELISA 方法  43-46
    2.3 基于酶标记抗原复合物的直接竞争 ELISA 方法  46-48
  3. 实验结果  48-57
    3.1 基于 MAb-HRP 的竞争 ELISA  48-49
    3.2 基于 MAb-AuNP-HRP 的竞争 ELISA  49-53
    3.3 基于 Cr-EDTA-HRP 的竞争 ELISA  53-54
    3.4 基于 Cr-EDTA-OVA-HRP 的直接竞争 ELISA  54-56
    3.5 基于 Ag-AuNP-HRP 的直接竞争 ELISA  56-57
  4 讨论  57-59
    4.1 基于纳米金颗粒的竞争 ELISA 方法的建立  57-58
    4.2 基于 Cr-EDTA-HRP 的直接竞争 ELISA  58-59
第四章 结论与展望  59-60
参考文献  60-66
在学期间发表论文清单  66-67
致谢  67

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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