学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

通络化痰胶囊对脑缺血损伤的保护作用及机制研究

作　者: 富苏
导　师: 范吉平
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 脑缺血损伤 PC12细胞通络化痰胶囊细胞凋亡线粒体途径
分类号: R277.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 152次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)是指由于各种原因引起脑部血液供应障碍、缺血缺氧导致脑组织坏死、软化,而出现局灶或完全神经功能缺损症状。缺血性脑卒中包括现代医学的脑血栓形成、脑栓塞和短暂性脑缺血发作,具有很高的发病率、致残率、病死率和复发率,是严重危害人类健康的疾病之一,成为世界性的医疗难题之一,也一直是药物研发领域关注的重点之一。细胞凋亡在脑缺血损伤中的作用日益受重视,研究认为无论是急性的局灶性脑缺血,还是短暂性脑缺血后的迟发性神经元死亡,都有神经细胞凋亡的参与,而凋亡在迟发性神经元死亡和半暗带的扩大中具有重要作用。这为临床治疗缺血性脑卒中提供新途径,因此应用药物阻止神经细胞凋亡成为当前国内外研究执占通络化痰胶囊,源于王永炎院士所创立的“毒损脑络”的理论,经导师范吉平教授依据多年中风病治疗的临床经验,在“化痰通络汤”的基础上加减配伍对脑损伤具有特殊保护作用的熊胆粉等药科学组方、总结优化而成,具有解毒、通络、化痰的三重作用,前期药效学研究和实际临床使用中均有着良好的功效。本课题将以脑缺血损伤后缺血半暗带区的细胞凋亡为切入点,通过体内和体外两个模型从整体、细胞、分子三个水平探讨通络化痰胶囊对脑缺血损伤的保护作用及作用机制,为中药治疗缺血性脑卒中提供进一步的机制探索和证据支持。第一章：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠的神经保护作用及机制研究第一节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠神经功能及神经元病理损害的影响目的：探讨通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠神经功能及神经元病理损害的影响。方法：98只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组、通络化痰高、中、低剂量组。通过永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)制备脑缺血损伤模型。于术后6h开始分别给予蒸馏水(正常对照组、假手术组、模型组)、尼莫地平(尼莫地平组,剂量为32.4mg·kg-1)和通络化痰胶囊(通络化痰高、中、低剂量组,剂量分别为648mg·kg-1,324mg·kg-1、162mg·kg-1)灌胃治疗,并于术后第1,2,3,5,7天行Narrow-Alley corner Test检测脑缺血损伤大鼠神经功能的改变,术后第8天行4%多聚甲醛(pH=7.0)灌注固定后断头取脑,通过HE染色和尼氏染色技术观察缺血脑组织的病理学改变。结果：(1)模型组大鼠第Id,2d,3d,5d和7d Narrow-Alley Corner Test得分较正常对照组和假手术组大鼠增加,有统计学差异(P<0.01)；尼莫地平组大鼠术后第Id,2d,3d,5d和7d Narrow-Alley Corner Test成绩均低于模型组,有统计学差异(P<0.01)；通络化痰胶囊高剂量组大鼠第3d Narrow-Alley Corner Test成绩低于模型组,有统计学差异(P<0.05),第1d,2d,5d和7d成绩与模型组相比,无统计学差异(P>0.05)；通络化痰胶囊中剂量组第1d,2d,3d,5d和7dNarrow-Al ley Corner Test成绩低于模型组,有统计学差异(P<0.01,P<0.05)；通络化痰胶囊低剂量组大鼠第1dNarrow-Alley Corner Test成绩低于模型组相比,有统计学差异(P<0.05),第2d,3d,5d和7d成绩与模型组相比,无统计学差异(P>0.05)。(2)模型组大鼠缺血脑组织坏死区内可见间质内大小不等的空泡,细胞核固缩、溶解,胞浆疏松,细胞界限不清,多见凋亡细胞。尼莫地平药组和通络化痰胶囊备剂量组大鼠脑组织可见坏死区减小,缺血半暗带区神经细胞、胞浆、胞核尚能分清,结构完整可辨的神经元数量较多。(3)模型组大鼠缺血半暗带内的尼氏小体明显减少,与正常对照组和假手术组相比较具有统计学差异(P<0.01)。尼莫地平组大鼠缺血半暗带内的尼氏小体与模型组相比增加,有统计学差异(P<0.01)。通络化痰胶囊各剂量组缺血半暗带内的尼氏小体与模型组相比增加,有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。结论：通络化痰胶囊可促进脑缺血损伤大鼠损伤后神经功能障碍的恢复,保护脑缺血损伤引起的相应脑区神经元的病理损害,修复相应脑区的结构、功能和代谢。第二节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响目的：探讨通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响。方法：98只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组、通络化痰高、中、低剂量组。通过永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)制备脑缺血损伤模型。于术后6h开始分别给予蒸馏水(正常对照组、假手术组、模型组)、尼莫地平(尼莫地平组,剂量为32.4mg·kg-1)和通络化痰胶囊(通络化痰高、中、低剂量组,剂量分别为648mg·kg-1、324mg·kg1、162mg·kg-1)灌胃治疗,术后第8天行4%多聚甲醛(pH=7.0)灌注固定后断头取脑,通过TUNEL技术测定缺血半暗带神经细胞凋亡的变化。结果：模型组大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡较正常对照组和假手术组大鼠增加,有统计学差异(P<0.01)；尼莫地平组大鼠缺血半暗带凋亡细胞数减少,与模型组相比有统计学差异(P<0.01)；通络化痰胶囊高剂量组大鼠缺血半暗带细胞凋亡数减少,与模型组相比,具有统计学差异(P<0.01)；通络化痰胶囊中剂量大鼠缺血半暗带细胞凋亡数减少,与模型组相比,具有统计学差异(P<0.01)；通络化痰胶囊低剂量组大鼠缺血半暗带细胞凋亡数减少,与模型组相比,具有统计学差异(P<0.05)。结论：通络化痰胶囊可减少脑缺血损伤大鼠缺血半暗带的神经细胞凋亡水平,这可能是通络化痰胶囊减轻脑缺血损伤大鼠损伤后神经功能障碍,保护脑缺血损伤引起的相应脑区神经元的病理损害,修复相应脑区的结构、功能和代谢的机制之一。第三节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带Bax和Bc1-2表达的影响目的：探讨通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带Bax和Bc1-2表达的影响。方法：98只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组、通络化痰高、中、低剂量组。通过永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)制备脑缺血损伤模型。于术后6h开始分别给予蒸馏水(正常对照组、假手术组、模型组)、尼莫地平(尼莫地平组,剂量为32.4mg·kg-1)和通络化痰胶囊(通络化痰高、中、低剂量组,剂量分别为648mg·kg-1、324mg·kg-1、162mg·kg-1)灌胃治疗,术后第8天行4%多聚甲醛(pH=7.0)灌注固定后断头取脑,通过免疫组化技术观察缺血半暗带Ba x和Bcl-2的变化。结果：模型组大鼠较正常对照组和假手术大鼠缺血半暗带Bax和Bcl-2表达增加,Bax/Bcl-2增加,有统计学差异(P<0.01).尼莫地平组大鼠较模型组大鼠缺血半暗带Bax表达减少,Bcl-2表达增加,Bax/Bc l-2降低,两者具有统计学差异(P<0.01)。通络化痰胶囊各剂量组大鼠较模型组大鼠缺血半暗带Bax表达减少,Bc1-2表达增加,Bax/Bc1-2降低,两者具有统计学差异(P<0.01)。结论：通络化痰胶囊促进缺血半暗带Bcl-2表达,抑制Bax表达,Bax/Bc l-2降低,这可能是其抑制缺血半暗带神经细胞凋亡、保护脑缺血损伤大鼠神经功能的机制之一第四节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带CytC、Caspase-9和Caspase-3的影响目的：探讨通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带CytC、Caspase-9和Caspase-3表达的影响。方法：98只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组、通络化痰高、中、低剂量组。通过永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)制备脑缺血损伤模型。于术后6h开始分别给予蒸馏水(正常对照组、假手术组、模型组)、尼莫地平(尼莫地平组,剂量为32.4mg·kg-1)和通络化痰胶囊(通络化痰高、中、低剂量组,剂量分别为648mg·kg-1、324mg·kg-1、162mg·kg-1)灌胃治疗,术后第8天通过免疫组化技术、western-blot和RT-PCR技术定性和半定量的从蛋白和mRNA水平测定缺血半暗带CytC、caspase-9和caspase-3的变化。结果：模型组大鼠较正常对照组和假手术组大鼠缺血半暗带CytC蛋白表达增加(P<0.01)、Caspase-9和Caspase-3蛋白和mRNA表达增加,具有统计学差异(P<0.01)。尼莫地平组大鼠较模型组大鼠缺血半暗带CytC蛋白表达减少、Caspase-9和Caspase-3蛋白和mRNA表达减少,具有统计学差异(P<0.01)。通络化痰胶囊各剂量组大鼠较模型组大鼠缺血半暗带CytC蛋白表达减少、Caspase-9和Caspase-3蛋白和mRNA表达减少,具有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。结论：通络化痰胶囊可以参与到脑缺血损伤后神经细胞的线粒体途径中,减少细胞凋亡线粒体途径中关键性级联蛋白CytC和Caspase-9和Caspase-3蛋白和mRNA的表达,这可能是其抑制缺血半暗带神经细胞凋亡、保护脑缺血损伤大鼠神经功能的机制之一。第二章：通络化痰对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究第一节：通络化痰胶囊对H2O2诱导的PC12细胞存活力的影响目的：探讨通络化痰胶囊对过氧化氢(H2O2)损伤的PC12细胞存活率的保护作用。方法：PC12细胞常规培养后,首先通过MTT检测细胞存活率的方法进行H2O2损伤模型的摸索和通络化痰胶囊药物浓度的筛选；确定造成PC12细胞损伤的H2O2浓度和通络化痰胶囊的安全作用浓度后,将处于对数生长期的PC12细胞分为对照组、模型组和通络化痰胶囊6.25,12.5,25,50,100μg·mL-15个治疗组。用200μg·mL-1H2O2刺激PC12细胞造成损伤模型,利用MTT法检测PC12细胞存活率。结果：200μg·mL-1H2O2诱导PC12细胞损伤明显。浓度小于等于100μg·mL-1的通络化痰胶囊浓度对正常PC12细胞的存活率有增值作用,不存在剂量相关性。与模型组比较,6.25,12.5,25,50,100μg·mL-1通络化痰治疗组PC12细胞存活率提高,具有统计学差异(P<0.01)。结论：通络化痰胶囊可增加H2O2损伤的PC12细胞的存活率。第二节：通络化痰胶囊对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响目的：探讨通络化痰胶囊对过氧化氢(H2O2)所致的PC12细胞凋亡的保护作用。方法：将处于对数生长期的PC12细胞分为对照组、模型组和通络化痰胶囊6.25μg·mL-1.25μg·mL-1、100μg·mL-13个治疗组。用200μg·mL-1H2O2刺激PC12细胞造成损伤模型,利用Hoechst33342荧光核染色观察细胞凋亡形态学改变、流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率。结果：与对照组相比,模型组细胞的PC12细胞凋亡率增加,两者具有统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,6.25μg·mL-1、25μg·mL-1、100μg·mL-1剂量的通络化痰治疗组PC12细胞凋亡率下降,具有统计学差异(P<0.01),其作用与剂量有关。H2O2处理的PC12细胞大多数细胞核核出现明显的固缩。与H2O2损伤组相比较,各通络化痰胶囊组固缩的细胞核的数量明显减少。结论：通络化痰胶囊可减少H2O2诱导的PC12细胞凋亡。第三节：通络化痰胶囊对H2O2诱导的PC12细胞中CytC和Caspase-3表达的影响目的：探讨通络化痰胶囊对过氧化氢(H2O2)所致的PC12细胞凋亡保护作用的可能机制。方法：将处于对数生长期的PC12细胞分为对照组、模型组和通络化痰胶囊6.25μg·mL-1、25μg·mL-1、100μg·m-13个治疗组。用200μg·mL-1H2O2刺激PC12细胞造成凋亡模型,Western blot方法检测(?)CytC和Caspase-3表达的变化。结果：模型组PC12细胞中与模型组比较,Cytc和Caspase-3的表达增加,两者具有统计学差异(P<0.01)。与模型组相比较,6.25μg·mL-1、25μg·mL-1、100μg·mL-1通络化痰治疗组PC12细胞中CytC和Caspase-3的表达减少,具有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。结论：通络化痰胶囊抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与参与细胞凋亡线粒体途径有关。

全文目录

中文摘要  5-9
Abstract  9-16
第一部分：综述  16-54
  综述一：脑缺血损伤的病理机制  16-31
  综述二细胞凋亡和脑缺血损伤  31-45
  综述三：中药治疗缺血性脑卒中实验研究的进展  45-54
第二部分：实验研究  54-117
  前言  54-56
  第一章：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠的神经保护作用及机制研究  56-95
    第一节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠神经功能及神经元病理损害的影响  56-69
      材料与方法  56-60
      结果  60-63
      讨论  63-66
      小结  66
      参考文献  66-69
    第二节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响  69-76
      材料与方法  69-71
      结果  71-72
      讨论  72-73
      小结  73-74
      参考文献  74-76
    第三节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带Bax和Bcl-2表达的影响  76-82
      材料与方法  76-78
      结果  78-79
      讨论  79-81
      小结  81
      参考文献  81-82
    第四节：通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠缺血半暗带CytC、Caspase-9和Caspase-3的影响  82-95
      材料与方法  82-87
      结果  87-91
      讨论  91-93
      小结  93
      参考文献  93-95
  第二章：通络化痰胶囊对H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究  95-117
    第一节：通络化痰胶囊对H_2O_2诱导的PC12细胞存活率的影响  95-105
      材料与方法  95-98
      结果  98-101
      讨论  101-103
      小结  103
      参考文献  103-105
    第二节：通络化痰胶囊对H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡的影响  105-111
      材料与方法  105-107
      结果  107-108
      讨论  108-110
      小结  110
      参考文献  110-111
    第三节：通络化痰胶囊对H_2O_2诱导的PC12细胞中CytC和Caspase-3表达的影响  111-117
      材料与方法  111-113
      结果  113-115
      讨论  115
      小结  115-116
      参考文献  116-117
结论  117
展望与思考  117-118
致谢  118-119
个人简历  119-121
附图  121-129

通络化痰胶囊对脑缺血损伤的保护作用及机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文