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牛磺酸拮抗锰致大鼠丘脑神经细胞损伤的体外实验研究

作　者: 黄玲
导　师: 郭松超
学　校: 广西医科大学
专　业: 营养与食品卫生
关键词: 锰 牛磺酸 丘脑神经细胞 氨基酸类神经递质
分类号: R151
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


[目的]应用新生大鼠丘脑神经细胞原代培养的方法,探讨谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、γ-氨基丁酸(GABA)三种氨基酸类神经递质,在牛磺酸(Tau)拮抗锰(Mn)诱导丘脑神经细胞损伤中的作用。[方法]取新生24小时以内的SPF级Wistar大鼠丘脑组织进行细胞原代培养,培养至最佳状态后,用于实验。先通过MTT实验筛选Mn和Tau处理浓度,将用于培养的丘脑神经细胞分组为：①空白对照组；②牛磺酸组；③低浓度染锰组；④中浓度染锰组；⑤高浓度染锰组；⑥低锰预防组；⑦中锰预防组；⑧高锰预防组。在各处理组加入处理因素24小时后终止培养,于倒置荧光显微镜下观察并拍照后进行以下检测：BCA法进行蛋白定量用于后续实验参考、高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内液及细胞外液中三种氨基酸类神经递质的浓度。[结果]1、通过MTT实验将牛磺酸干预浓度确定为4mmol/L,将染锰的低、中、高浓度分别确定为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L。2、与空白对照组比较,单纯牛磺酸干预条件下细胞铺展更充分、细胞密度更高；染锰可以导致丘脑神经细胞形态改变、活细胞数量减少,且细胞形态、活细胞数量的改变程度随着染锰浓度的增加而增大；相对于对应的染锰组,牛磺酸预防组细胞形态较完整、活细胞数量较多,但细胞形态改变、活细胞数量减少的程度随着染锰浓度的增加逐渐增大；3、HPLC检测显示：①细胞外：与空白对照组比较,牛磺酸组Glu浓度降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组Glu浓度均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)；Glu浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,各染锰组之间差异均有统计学意义(P<0.01)；牛磺酸预防各组Glu浓度均低于对应的染锰组,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,Glu浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,牛磺酸组Gln浓度降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组Gln浓度均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)；Gln浓度随着染锰浓度的增加逐渐降低,各染锰组间差异均有统计学意义(P<0.01)；与对应的染锰组比较,牛磺酸预防各组Gln浓度均较低,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,Gln浓度随着染锰浓度的增加逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,牛磺酸组GABA浓度显著提高,差异有统计学意义(P<0.01)与空白对照组比较,染锰各组GABA浓度均有所提高,但只有高浓度染锰组差异有统计学意义(P<0.05)；GABA浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,但各染锰组间差异均无统计学意义(P>0.05)；与对应的染锰组比较,牛磺酸预防各组GABA浓度均明显提高,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,GABA浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。②细胞内：与空白对照组比较,牛磺酸组Glu浓度明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组Glu浓度均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)；Glu浓度随着染锰浓度的增加而逐渐提高,各染锰组间差异均有统计学意义(P<0.01)；与对应的染锰组比较,牛磺酸预防各组Glu浓度均较低,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,Glu浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,牛磺酸组Gln浓度降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组Gln浓度均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)；随着染锰浓度的增加,Gln浓度逐渐降低,各染锰组间差异均有统计学意义(P<0.01)；牛磺酸预防各组Gln浓度均高于对应的染锰组,差异均有统计学意义(P<0.01)各预防组之间,Gln浓度随着染锰浓度的增加逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,牛磺酸组GABA浓度显著提高,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组GABA浓度有所下降,差异均有统计学意义(P<0.01)；随着染锰浓度的增加,GABA浓度逐渐下降,各染锰组间差异均有统计学意义(P<0.01)；与对应的染锰组比较,牛磺酸预防各组GABA浓度均明显提高,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,GABA浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。③细胞外液与细胞内液3种氨基酸类神经递质的平均浓度：与空白对照组比较,牛磺酸组Glu平均浓度降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组Glu平均浓度均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)；随着染锰浓度的增加,Glu平均浓度逐渐提高,各染锰组间差异均有统计学意义(P<0.01)；牛磺酸预防各组Glu平均浓度均低于对应的染锰组,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,Glu平均浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,牛磺酸组Gln平均浓度降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组Gln平均浓度均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)；随着染锰浓度的增加,Gln平均浓度逐渐降低,各染锰组间差异均有统计学意义(P<0.01)；与对应的染锰组比较,牛磺酸预防各组Gln平均浓度均较低,差异均有统计学意义(P<0.01)：各预防组之间,Gln平均浓度随着染锰浓度的增加逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,牛磺酸组GABA平均浓度显著提高,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组GABA平均浓度有所提高,但差异均无统计学意义(P>0.05)；随着染锰浓度的增加,GABA平均浓度逐渐提高,但各染锰组间差异均无统计学意义(P>0.05)；与对应的染锰组比较,牛磺酸预防各组GABA平均浓度均明显提高,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,GABA平均浓度随着染锰浓度的增加逐渐提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。④Glu平均浓度/GABA平均浓度：与空白对照组比较,牛磺酸组(Glu平均浓度/GABA平均浓度)的值降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较,染锰各组(Glu平均浓度/GABA平均浓度)的值均明显增高,差异均有统计学意义(P值均<0.01)；与低浓度染锰组比较,中、高浓度染锰组(Glu平均浓度/GABA平均浓度)的值显著提高,差异均有统计学意义(P<0.01)；中、高浓度染锰组之间,(Glu平均浓度/GABA平均浓度)的值差异无统计学意义(P>0.05)；牛磺酸预防各组(Glu平均浓度/GABA平均浓度)值均低于对应的染锰组,差异均有统计学意义(P<0.01)；各预防组之间,(Glu平均浓度/GABA平均浓度)的值随着染锰浓度的增加逐渐提高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。[结论]锰可致体外原代培养的丘脑神经细胞损伤,牛磺酸可在一定程度上拮抗此毒作用；Glu可能在锰致体外原代培养的丘脑神经细胞损伤机制中起到重要作用,GABA可能在牛磺酸拮抗锰致体外原代培养的丘脑神经细胞损伤中机制起到重要作用。

全文目录


缩略语表  6-7
摘要  7-11
ABSTRACT  11-18
一、前言  18-21
二、材料与方法  21-30
  1、材料  21-24
    1.1 、实验动物  21
    1.2 、仪器设备  21-22
    1.3 、主要试剂  22-23
    1.4 、常用溶液配制  23-24
  2、实验方法  24-30
    2.1 、丘脑神经细胞原代培养  24-25
    2.2 、MTT法筛选实验各组处理因素  25-26
    2.3 、显微镜下观察细胞状态  26
    2.4 、裂解液法提取细胞蛋白  26
    2.5 、BCA法进行蛋白定量  26-27
    2.6 、高效液相色谱法测定3种氨基酸类神经递质的浓度  27-30
  3、统计学分析方法  30
三、结果  30-54
  1、MMT法确定的实验分组及各组处理因素的浓度  30-36
    1.1 、从7个染锰浓度中选出毒性效果较明显的3个浓度  30-31
    1.2 、从5个牛磺酸浓度中选出促进效果较明显的3个浓度  31
    1.3 、从9个预防组中选出预防效果较明显的3个组  31
    1.4 、确定本研究中各组的锰、牛磺酸浓度  31-36
  2、形态学差异  36-38
  3、锰、牛磺酸干预后丘脑神经细胞内、外3种氨基酸类神经递质的变化  38-54
    3.1 、本实验条件下所测数据的准确性、可重复性  38
    3.2 、细胞内、外3种氨基酸类神经递质受锰、牛磺酸的影响  38-54
四、讨论  54-65
  1、丘脑神经细胞损伤模型的建立  54-56
  2、牛磺酸拮抗锰诱导的丘脑神经细胞损伤的形态学表现  56-58
    2.1 、概况  56
    2.2 、单纯牛磺酸干预条件下的细胞状态  56
    2.3 、不同染锰浓度致细胞形态学变化  56-57
    2.4 、牛磺酸预防使细胞损伤得以改善  57
    2.5 、小结  57-58
  3、3种氨基酸类神经递质在牛磺酸拮抗锰诱导的体外原代培养的丘脑神经细胞损伤中的作用  58-65
    3.1 、本实验的准确性和可重复性  58-59
    3.2 、单纯牛磺酸干预对体外原代培养的丘脑神经细胞内、外3种氨基酸类神经递质的影响  59
    3.3 、锰对体外原代培养的丘脑神经细胞内、外3种氨基酸类神经递质的影响  59-62
    3.4 、牛磺酸拮抗锰的神经细胞毒作用机制中3种氨基酸类神经递质的变化  62-63
    3.5 、小结  63-65
五、结论及展望  65-66
参考文献  66-70
综述  70-78
  参考文献  74-78
攻读硕士学位期间发表的论文目录  78-79
致谢  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 营养卫生、食品卫生 > 营养学
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