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东北梅花鹿茸生长期顶端组织差异表达基因的筛选和鉴定

作 者: 丁玲
导 师: 李和平; 夏彦玲
学 校: 东北林业大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 东北梅花鹿 鹿茸 间充质组织 mRNA差异显示技术 基因表达
分类号: S825
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


鹿茸是哺乳动物中惟一能够再生的组织器官,因此鹿茸为哺乳动物组织器官再生的研究提供了独特的模型。研究已表明鹿茸发育属软骨内成骨,其再生基于干细胞而不涉及细胞的去分化;在鹿茸生长过程中,细胞的分化、增殖、凋亡都受到特定基因的表达调控;但其再生及其生长发育的分子机制迄今还并不十分清楚。本试验采用mRNA差异显示PCR技术筛选东北梅花鹿茸生长过程中小鞍子(前期)、二杠茸(中期)和三权茸(后期)顶端间充质组织的差异表达基因片段,共获得45条鹿茸生长过程中差异表达片段,回收了15条,其中14条克隆测序,经Blast比对发现5条序列(EST1、EST2、EST3、EST4和EST5)分别与已知基因(COL9A3、MALAT1、 LOX、BCLAF1)高度同源,EST3与EST5来源于LOX基因,其它序列在数据库中均无同源基因。采用实时定量PCR进一步检测LOX基因表达水平,与mRNA差异显示结果基本一致。本试验初步发现:COL9A3在鹿茸生长前期不表达,后期的表达量大于中期;MALAT1在鹿茸生长中期表达量最高,前期至中期表达上调,中期至后期表达下调;LOX在鹿茸生长中、后期的表达量大于前期;BCLAF1只在鹿茸生长的后期表达。实时定量结果显示:鹿茸间充质生长的3个时期,LOX mRNA表达水平呈上调趋势,中期表达量最高,显著高于前期(P<0.05),后期与前期、中期差异均不显著(P>0.05),提示该基因参与鹿茸间充质前期至后期的生长,推测其可能促进了间充质细胞的快速增殖,协同其它因子使胶原蛋白与弹性蛋白形成分子间的交联,稳定细胞外基质,保持细胞外内环境稳定。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-15
  1.1 鹿茸的生长发育规律  9-11
    1.1.1 鹿茸生长发育的组织结构  9-10
    1.1.2 鹿茸的再生机理  10-11
    1.1.3 鹿茸的组织发生  11
    1.1.4 鹿茸的器官形成  11
  1.2 鹿茸生长发育过程中的组织学特性  11-12
  1.3 鹿茸生长发育调控  12
  1.4 mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术简介  12-14
    1.4.1 DDRT-PCR技术的原理  12-13
    1.4.2 DDRT-PCR技术的发展  13
    1.4.3 DDRT-PCR技术的优点与局限性  13-14
  1.5 本研究的目的及意义  14-15
2 材料与方法  15-24
  2.1 样品采集  15
  2.2 网络资源及软件  15
  2.3 试剂及引物  15-17
    2.3.1 主要试剂及试剂盒  15-16
    2.3.2 电泳所需溶液配方  16
    2.3.3 染色溶液的配制  16-17
    2.3.4 LB培养基的配制  17
    2.3.5 mRNA差异显示PCR引物  17
  2.4 仪器设备  17-18
  2.5 试验方法  18-23
    2.5.1 鹿茸间充质的获取  18
    2.5.2 鹿茸间充质总RNA的提取  18-19
    2.5.3 RNA纯化  19-20
    2.5.4 cDNA的合成  20
    2.5.5 DDRT-PCR反应  20
    2.5.6 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳  20-21
    2.5.7 银染法显色  21
    2.5.8 差异片段的切取  21
    2.5.9 差异片段的二次扩增  21
    2.5.10 二次扩增产物的回收  21-22
    2.5.11 PCR产物克隆  22
    2.5.12 Real-time PCR定量分析  22-23
  2.6 本章小结  23-24
3 结果  24-33
  3.1 RNA纯度与完整性  24
  3.2 mRNA差异显示结果  24-26
  3.3 差异片段的回收与再扩增  26-27
  3.4 再扩增产物的克隆及阳性克隆的鉴定  27
  3.5 差异片段序列的测序及同源性分析结果  27-31
  3.6 实时定量PCR结果  31-32
    3.6.1 RNA纯度和完整性  31
    3.6.2 LOX基因实时实时定量PCR扩增产物的电泳检测  31
    3.6.3 实时定量PCR扩增曲线  31
    3.6.4 实时定量PCR熔解曲线  31-32
    3.6.5 LOX基因表达的相对定量  32
  3.7 本章小结  32-33
4 讨论  33-38
  4.1 应用改进的DDRT-PCR方法获得差异基因表达序列  33
  4.2 差异条带的筛选  33
  4.3 部分差异序列功能分析  33-38
    4.3.1 EST1  33-34
    4.3.2 EST2  34-35
    4.3.3 EST3与EST5  35-36
    4.3.4 EST4  36-38
结论  38-39
参考文献  39-46
攻读学位期间发表的学术论文  46-47
致谢  47-48

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 鹿
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