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油茶特异DNA片段的克隆与序列分析

作 者: 马跃
导 师: 陈辉
学 校: 福建农林大学
专 业: 森林生态学
关键词: 油茶 分子标记 特异片段 克隆 序列分析
分类号: S794.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


油茶是我国长江以南各省地的主要油料树种,已有众多优良品种被选育出来进行推广种植。本文利用ISSR与SRAP两种分子标记方法分别对优良品种进行遗传分析,在少数品种中发现了特异DNA片段,对特异片段进行回收、克隆、测序及序列分析。主要研究结果和结论如下:(1)对传统的DNA提取方法进行改进,选用1.5ml的离心管,药品浓度与反应过程进行优化,不仅减少材料和药品的使用还降低了杂质的含量,提取质量完全符合分子标记要求。(2)本实验选择了ISSR与SRAP两种分子标记方法。通过实验筛选出ISSR与SRAP的反应体系。ISSR反应体系为:DNA30ng,镁离子2.0mm/l,dNTP0.2mm/l,酶0.5u,引物1.5μm/l,总反应体系20μl,反应过程中退火温度选择55℃,持续45s。SRAP反应体系为:DNA30ng,镁离子2.25mm/l,dNTP0.3mm/l,酶1.0u,引物正反各1.0μm/l,总反应体系20μl。反应过程中主要步骤循环1的退火步骤35℃持续1min,循环2的退火步骤55℃持续1min。(3)ISSR分子标记中共发现13个特异片段,通过试剂盒回收,克隆、测序及序列分析得出:其中最长的片段有1509个碱基组成,最短的片段只有174bp大。每个片段都能找到与其相似的基因片段,有个别相似度达到了100%,其余的相似系数都在70%-80%之间。一致性序列比较短,只占有全序列的40%左右,所有片段配对比较只有少数几个没有配对缺口,大部分都有缺口存在,最多的有10个缺口。大部分序列中都能找到不止1个开放性阅读框,最多的可以编码306个氨基酸多肽,少的也可以编码41个。在NCBI中进行氨基酸同源对比,共有8个片段可以匹配出相近的氨基酸序列。(4)在SRAP分子标记中共发现了7个特异性片段,通过试剂盒回收,克隆、测序及序列分析得出:7个特异性片段都分布在300bp-610bp之间。每个片段都能找到与其相似的基因片段,相似系数主要集中在80%左右,有个别达到了100%,一致性序列长度不是很短,有接近400个碱基组成,占有全序列的66%。在配对比较结果中全部片段都有缺口存在,最多的达到24个,最少的只有1个,一致性序列长度除了个别的比较短,其他的都大于200bp。每个序列中都能找到1个或多个开放性阅读框,最多的可以编码83个氨基酸多肽,少的也可以编码27个。在NCBI中进行氨基酸同源对比,共有4个片段可以匹配出相近的氨基酸序列。(5)特异片段的发现可以作为一种有效的种质资源鉴定方法。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
1 前言  10-21
  1.1 国内外油茶种质资源研究概况  10-13
    1.1.1 油茶的分布  10-11
    1.1.2 油茶的形态学特征  11-12
    1.1.3 油茶生物学特征  12
    1.1.4 油茶种质资源鉴定  12-13
  1.2 生物信息学概况  13
  1.3 分子标记在油茶上的应用  13-20
    1.3.1 遗传标记概况  13-14
    1.3.2 分子标记技术的研究概况  14-18
      1.3.2.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)  14-15
      1.3.2.2 SSR (Simple Sequence Repeat)  15
      1.3.2.3 ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)  15-16
      1.3.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)  16
      1.3.2.5 SRAP (Sequence-Relate Amplified Polymorphism)  16-17
      1.3.2.6 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)  17-18
    1.3.3 分子标记在油茶上应用  18-20
      1.3.3.1 研究状况  18-20
      1.3.3.2 存在的问题  20
  1.4 特异 DNA 片段及回收分析  20-21
  1.5 本研究目的和意义  21
2 材料与方法  21-36
  2.1 实验材料  21-24
  2.2 试验方法  24-36
    2.2.1 实验器材  24
    2.2.2 酶及生化试剂  24
    2.2.3 主要试剂的配制  24-25
    2.2.4 油茶基因组总 DNA 提取  25-31
      2.2.4.1 不同叶片取材对 DNA 提取效果的影响  25-26
      2.2.4.2 不同叶片用量对 DNA 提取效果的影响  26-27
      2.2.4.3 不同β-巯基乙醇用量对 DNA 提取效果的影响  27-28
      2.2.4.4 不同 CTAB 用量对 DNA 提取效果的影响  28-29
      2.2.4.5 不同 PVP 浓度对 DNA 提取效果的影响  29-31
    2.2.5 PCR 反应体系和程序  31-32
    2.2.6 SRAP 反应体系与程序  32-33
    2.2.7 特异条带回收、克隆及测序  33-36
      2.2.7.1 条带回收  33-34
      2.2.7.2 DNA 克隆与测序  34-36
    2.2.8 序列分析  36
3 结果与分析  36-62
  3.1 油茶总 DNA 浓度与质量检测  36-38
    3.1.1 琼脂糖电泳检测  36-37
    3.1.2 紫外线分光光度计检测  37-38
  3.2 ISSR 标记分析  38-49
    3.2.1 ISSR-PCR 反应结果  38-41
    3.2.2 特异片段回收检测  41-43
    3.2.3 测序结果  43-49
  3.3 SRAP 标记分析  49-54
    3.3.1 SRAP-PCR 反应结果  49-51
    3.3.2 特异片段回收检测  51-52
    3.3.3 测序结果  52-54
  3.4 特异片段克隆分析  54-62
    3.4.1 ISSR 标记特异片段克隆分析  54-59
      3.4.1.1 序列基本信息  54-55
      3.4.1.2 数据库对比结果  55-57
      3.4.1.3 序列编码分析  57
      3.4.1.4 氨基酸比对  57-58
      3.4.1.5 结论  58-59
    3.4.2 SRAP 标记特异片段克隆分析  59-62
      3.4.2.1 序列基本信息  59
      3.4.2.2 数据库对比结果  59-61
      3.4.2.3 氨基酸序列分析  61
      3.4.2.4 氨基酸比对  61-62
      3.4.2.5 结论  62
    3.4.3 小结  62
4 结论与讨论  62-66
  4.1 结论  62-64
    4.1.1 油茶叶片 DNA 的提取  62-63
    4.1.2 分子标记  63
    4.1.3 琼脂糖胶回收  63-64
    4.1.4 序列分析  64
  4.2 讨论  64-66
参考文献  66-71
致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 特用阔叶树类 > 油茶
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