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拟南芥AT14A蛋白的功能研究-AT14A与细胞壁的组成

作 者: 胡静
导 师: 吕冰; 梁建生
学 校: 扬州大学
专 业: 植物学
关键词: 拟南芥 AT14A蛋白 细胞壁多糖 细胞壁蛋白 类整合素
分类号: Q946
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


AT14A是拟南芥中一个与动物整合素具有部分同源序列的功能未知的蛋白。整合素是动物细胞质膜上介导胞外基质一质膜一细胞骨架连续体的重要中间分子,调控了细胞间的相互粘附和细胞内外的信号转导。植物细胞与动物细胞的差别之一在于表面结构的不同。植物细胞表面的由多糖和少量的蛋白等构成的复杂网状结构——细胞壁与质膜、细胞骨架也构成了一个信号转导连续体系。AT14A蛋白氨基酸序列中有一段与整合素相似的保守序列,提示其可能作为细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的中间成员参与了细胞内外的信号转导过程。本研究以拟南芥为试验材料,对AT14A蛋白与细胞壁组成之间的关系进行了研究,主要结果如下:1.采用农杆菌介导的转基因方法,将AT14A-GFP融合基因转至拟南芥野生型植株以及悬浮细胞中,获得了相应的转基因株系和悬浮细胞系。完整植物材料体系的建立为研究AT14A的功能创造了条件。在转AT14A-GFP融合基因植株叶片下表皮细胞和气孔保卫细胞膜部位出现了GFP的特异绿色荧光,验证了AT14A是一个膜蛋白。2.对三种AT14A相关基因型拟南芥细胞壁多糖组分的测定结果表明,过表达株系AT14A细胞壁的纤维素含量显著高于野生型和突变体;与野生型和过表达株系相比,缺失型突变体at14a细胞壁的果胶类物质含量显著增加;而过表达和突变体细胞壁葡聚糖的含量均比野生型有显著增加。以上结果表明,无论AT14A的过表达还是缺失,都会改变拟南芥植株细胞壁多糖组分的构成。3.改进了拟南芥植株细胞壁蛋白的提纯方法。对改进前后壁蛋白的提取效果比较分析表明,增加C18过柱和丙酮沉淀步骤,有助于细胞壁蛋白的纯化和减少损耗,并能有效提高电泳质量和重复率。4.对三种AT14A相关基因型拟南芥细胞壁蛋白双向电泳结果比较分析获得的16个差异蛋白点进行了MALDI-TOF-MS分析和数据库检索鉴定,共有11个目的蛋白质得到了鉴定,在9个具有确定功能的蛋白中有2个蛋白与细胞壁组成直接相关——木葡聚糖水解酶(XTH7)和ADP核糖基化因子(ARF)型小G蛋白的鸟苷交换因子(EMB30)。5.通过酵母双杂交的方法对与AT14A互作的蛋白进行了筛选,以AT14A-N端胞内序列为诱饵,在cDNA表达文库中筛选得到了一个可能与细胞壁相关的蛋白——TSK相关蛋白1(TSA1);而以AT14A-C端序列为诱饵筛选得到的4个与细胞壁代谢相关或参与抗逆过程相关的蛋白,其中的α-木糖甘酶更直接参与了木聚糖和木葡聚糖的代谢过程。总之,AT14A与细胞壁的组成有密切的关系,其很可能作为细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的中间分子介导了细胞内外的信号转导过程。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
英文縮略词  9-11
第一章 文献综述  11-25
  1.1 引言  11
  1.2 整合素蛋白的研究  11-15
    1.2.1 整合素蛋白的结构与功能  11-13
    1.2.2 整合素蛋白的作用机理  13-15
  1.3 植物类整合素蛋白的研究  15-18
    1.3.1 植物类整合素蛋白的检测定位  15-17
    1.3.2 植物类整合素蛋白的功能  17-18
  1.4 植物细胞壁的结构与功能  18-21
    1.4.1 植物细胞壁的结构  18-20
    1.4.2 植物细胞壁在逆境胁迫的响应中的功能  20-21
      1.4.2.1 水分亏缺  20
      1.4.2.2 低温胁迫  20-21
      1.4.2.3 重金属胁迫  21
  1.5 蛋白质组学研究进展  21-24
    1.5.1 蛋白质组学研究的历史和背景  21-22
    1.5.2 蛋白质组学研究的相关技术  22-23
      1.5.2.1 双向电泳(2-DE)及其相关技术  22
      1.5.2.2 生物质谱技术(Mass Spectrometry)  22
      1.5.2.3 酵母双杂系统  22-23
      1.5.2.4 生物信息学  23
    1.5.3 拟南芥蛋白质组学研究进展  23-24
      1.5.3.1 突变体蛋白质组学  23
      1.5.3.2 组织和器官蛋白质组学  23
      1.5.3.3 亚细胞水平蛋白质组学  23-24
    1.5.4 细胞壁蛋白质组学  24
  1.6 结语  24-25
第二章 材料与方法  25-42
  2.1 仪器与试剂  25-27
    2.1.1 仪器  25-26
    2.1.2 试剂  26-27
  2.2 实验材料与方法  27-42
    2.2.1 植物及菌株材料  27-29
      2.2.1.1 根癌农杆菌介导法培育转基因拟南芥植株  27-28
        2.2.1.1.1 野生型拟南芥植株的培育  27
        2.2.1.1.2 根癌农杆菌阳性克隆的目的基因序列的PCR鉴定  27
        2.2.1.1.3 根癌农杆菌阳性克隆的GFP基因序列的PCR鉴定  27-28
        2.2.1.1.4 根癌农杆菌的培养及其介导的拟南芥转化  28
        2.2.1.1.5 转AT14A-GFP融合基因拟南芥种子的抗性筛选  28
        2.2.1.1.6 转AT14A-GFP融合基因拟南芥植株目的片段与GFP的PCR鉴定  28
      2.2.1.2 根癌农杆菌介导法培育转基因拟南芥悬浮细胞  28-29
        2.2.1.2.1 转AT14A-GFP融合基因拟南芥悬浮细胞体系的培育  28-29
        2.2.1.2.2 转AT14A-GFP融合基因拟南芥悬浮细胞目的片段与GFP的PCR鉴定  29
      2.2.1.3 缺失型突变体at14a植株以及悬浮细胞鉴定与培育  29
      2.2.1.4 转基因株系GFP荧光定位研究  29
    2.2.2 细胞壁多糖组分测定  29-32
      2.2.2.1 纤维素含量的测定 #19蒽酮法(Schrick et al.,2004)  29-31
      2.2.2.2 果胶含量的测定 #21咔唑比色法(朴一龙等,2006;丁建东等,2010)  31-32
      2.2.2.3 β-葡聚糖的测定 #22苯酚硫酸法(陈玲玲等,2011)  32
    2.2.3 壁蛋白的提取及分析  32-39
      2.2.3.1 拟南芥壁蛋白的提取  32-33
      2.2.3.2 蛋白含量的测定及壁蛋白纯度的鉴定  33-34
      2.2.3.3 双向电泳  34-39
        2.2.3.3.1 溶液配制  34-35
        2.2.3.3.2 蛋白样品预处理  35-36
        2.2.3.3.3 第一向固相pH等电聚焦  36-37
        2.2.3.3.4 第二向SDS-PAGE  37-38
        2.2.3.3.5 考马斯亮蓝染色  38
        2.2.3.3.6 胶的保存  38
        2.2.3.3.7 质谱鉴定差异蛋白质  38-39
        2.2.3.3.8 MALDI-TOF法测定肽质量指纹图谱(PMF)  39
        2.2.3.3.9 搜索数据库分析差异蛋白质  39
    2.2.4 与AT14A互作的细胞壁相关蛋白分析  39-42
      2.2.4.1 重组诱饵质粒pGBKT7/AT14A-N(AT14A-C)的构建  39
      2.2.4.2 cDNA文库筛选流程  39-40
      2.2.4.3 重组诱饵质粒pGBKT7/AT14A-N(AT14A-C)转化酵母菌株AH109  40
      2.2.4.4 重组诱饵质粒pGBKT7/AT14A-N(AT14A-C)自激活及毒性检测  40
      2.2.4.5 cDNA文库筛选  40-42
第三章 实验结果与分析  42-61
  3.1 拟南芥AT14A相关基因型植物材料体系的建立  42-46
    3.1.1 转AT14A-GFP融合基因的根癌农杆菌阳性克隆的PCR鉴定  42
    3.1.2 转AT14A-GFP融合基因植株的抗性筛选与PCR鉴定  42-43
    3.1.3 转AT14A-GFP融合基因愈伤的筛选与悬浮细胞系的PCR鉴定  43-44
    3.1.4 缺失型突变体at14a植株鉴定  44-45
    3.1.5 转AT14A-GFP融合基因植株叶表皮荧光观察  45-46
  3.2 拟南芥AT14A相关基因型株系细胞壁多糖组分测定  46-48
    3.2.1 纤维素含量  46-47
    3.2.2 果胶类物质含量  47-48
    3.2.3 葡聚糖含量  48
  3.3 拟南芥AT14A相关基因型株系细胞壁蛋白双向电泳与差异比较  48-58
    3.3.1 细胞壁蛋白的免疫印记鉴定  48-49
    3.3.2 细胞壁蛋白提取方法的改进  49-50
    3.3.3 拟南芥AT14A相关基因型株系细胞壁蛋白双向电泳比较分析  50-54
    3.3.4 拟南芥AT14A相关基因型株系细胞壁差异蛋白质点的质谱分析  54-58
  3.4 与AT14A互作的细胞壁相关蛋白分析  58-61
第四章 小结与展望  61-64
  4.1 小结  61-62
  4.2 展望  62-64
参考文献  64-71
附录  71-73
致谢  73-74

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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