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Rhodococcus sp.R04细胞色素P450单加氧酶多态性及CYP125的功能研究

作　者: 薛瑞
导　师: 杨秀清
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: Rhodococcus sp.R04 细胞色素P450单加氧酶 CYP125 胆固醇
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450,CYP),是一类催化单加氧反应酶的超家族,它广泛地存在于从低等的微生物到高等的哺乳动物等各种生命体中。CYP具有代谢众多生命体内源和外源性物质的功能。这类酶能表现出特殊的光谱性质,其还原态与CO结合后,能在450nm处产生特征吸收峰,这也是P450得名的缘由。Rhodococcus sp. R04基因组测序发现,Rhodococcus sp. R04中含有至少15种细胞色素P450单加氧酶,它们分别从属于13个家族,并由Cytochrome P450命名委员会予以命名,它们分别是CYP102C3、CYP116B4、CYP123A6、CYP125A18、CYP125B2、 CYP136C4、 CYP136C5P、CYP150A16、CYP152F1、CYP153A32、CYP185B1、 CYP186C1、CYP255A3、CYP255A4和CYP51B1.通过序列比对发现这15种细胞色素P450单加氧酶的总相似性仅有14.64%,但其比对结果显示所有的P450酶都具有保守的螺旋K区"EXXR"与血红素结合区"FGXGXXXCXG".系统发育分析表明,CYP125A18、CYP125B2与Rhodococcus sp.RHA1和Mycobacterium tuberculosis中的CYP为同一族群,而该族群被证实能催化cholest-4-en-3-one的27位碳原子并能进入细胞质中催化胆固醇侧链的碳原子,另外CYP125家族与Pseudomonas sp的P450terp有相同的起源,此酶具有α-松油醇羟化酶活性。基因注释表明,Rhodococcus sp. R04中有两种CYP125,分别是CYP125B2和CYP125A18.我们对这两种CYP125进行了克隆、表达纯化以及相关性质的研究。结果表明,氧化态CYP125B2和CYP125A18在417.5和422nm出现特征吸收峰,还原态CYP125B2和CYP125A18与CO结合后,与氧化态的差示光谱显示它们在450和458nm会产生差示峰,这与一般的细胞色素P450单加氧酶的典型特征相同。同时运用光学滴定法测定克霉唑,硝酸益康唑,甲硝唑,酮康唑,4-苯基咪唑和4-甲基-2-苯基咪唑六种不同的唑类药物与CYP125B2和CYP125A18的相互作用,并计算Kd值,分析这几种唑类药物分别与CYP125B2和CYP125A18的结合程度,实验结果表明CYP125B2与六种唑类药物的结合程度依次是4-苯基咪唑>硝酸益康唑>克霉唑>酮康唑>4-甲基-2-苯基咪唑>甲硝唑,而CYP125A18是酮康哗>硝酸益康唑>克霉唑>4-甲基-2-苯基咪唑>甲硝唑>4-苯基咪唑。目前,我们已经发现Rhodococcus sp. R04能够在以胆固醇为唯一碳源的培养基上生长,并且能将胆固醇转化,但所生成物质的结构尚不明确。另外,据报道CYP125在降解胆固醇,类固醇等脂肪族化合物中起关键作用。我们推测Rhodococcus sp. R04中的CYP125B2和CYP125A18两种CYP125参与了Rhodococcus sp. R04降解胆固醇的途径,但它们在这一过程中的具体作用还是未知的,尚需进一步的实验证明。

全文目录

中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一章文献综述  15-33
  1 细胞色素P450单加氧酶概述  15-16
  2 细胞色素P450单加氧酶的结构  16-18
  3 细胞色素P450单加氧酶的功能  18-26
    3.1 细胞色素P450的催化机制  18-21
    3.2 细胞色素P450催化的反应类型  21-26
  4 P450转化胆固醇  26-27
  5 细胞色素P450单加氧酶的多样性  27-29
    5.1 细胞色素P450单加氧酶的类型  28
    5.2 细胞色素P450单加氧酶的命名  28-29
  6 本论文研究的目的和意义  29
  参考文献  29-33
第二章 Rhodococcus sp.R04中细胞色素P450单加氧酶多态性  33-41
  1 Rhodococcus sp.R04中细胞色素P450概况  33-35
  2 Rhodococcus sp.R04中CYP序列分析  35-38
    2.1 Rhodococcus sp.R04中CYP一级结构序列比对  35-36
    2.2 CYP系统发育分析  36-38
  3 讨论  38-39
  参考文献  39-41
第三章 Rhodococcus sp.R04 CYP125B2的表达纯化和部分性质研究  41-54
  1 材料  41-42
    1.1 菌株和载体  41-42
    1.2 培养基  42
    1.3 主要的酶和化学试剂  42
    1.4 主要的仪器设备  42
  2 方法  42-45
    2.1 Rhodococcus sp.R04细胞色索单加氧酶基因cyp125B2的克隆  42
    2.2 cyp125B2基因的表达  42-44
    2.3 细胞色素P450单加氧酶CYP125B2的纯化  44
    2.4 蛋白含量测定  44-45
    2.5 CYP125B2的紫外可见光谱扫描  45
    2.6 CYP125B2的唑类药物滴定  45
  3 结果  45-50
    3.1 Rhodococcus sp.R04中cyp125B2基因的扩增及重组子的鉴定  45-46
    3.2 CYP125B2的表达纯化  46-47
    3.3 CYP125B2的紫外可见光谱分析  47-48
    3.4 CYP125B2的哗类药物滴定分析  48-50
  4 讨论  50-51
  参考文献  51-54
第四章 Rhodococcus sp.R04 CYP125A18的表达纯化和部分性质研究  54-65
  1 材料  55-56
    1.1 菌株和载体  55
    1.2 培养基  55
    1.3 主要的酶和化学试剂  55
    1.4 主要的仪器设备  55-56
  2 方法  56-58
    2.1 Rhodococcus sp.R04细胞色素单加氧酶基因cyp125A18的克隆  56
    2.2 cyp125A18基因的表达  56-57
    2.3 细胞色素P450单加氧酶CYP125A18的纯化  57
    2.4 蛋白含量测定  57
    2.5 CYP125A18的紫外可见光谱扫描  57-58
    2.6 CYP125A18的唑类药物滴定  58
  3 结果  58-62
    3.1 Rhodococcus sp.R04中cyp125A18基因的扩增及重组子的鉴定  58
    3.2 CYP125A18的表达纯化  58-59
    3.3 CYP125A18的紫外可见光谱分析  59-60
    3.4 CYP125A18的唑类药物滴定分析  60-62
  4 讨论  62-63
  参考文献  63-65
第五章 Rhodococcus sp.R04转化胆固醇的研究  65-74
  1 材料  65-66
    1.1 菌株来源  65
    1.2 实验仪器与试剂  65-66
    1.3 培养基  66
  2 方法  66-67
    2.1 菌株的活化及培养  66
    2.2 胆固醇降解分析  66-67
  3 结果  67-70
    3.1 菌株的生长情况  67
    3.2 菌株降解胆固醇的HPLC分析  67-70
  4 讨论  70-72
  参考文献  72-74
小结  74-76
攻读学位期间取得的研究成果  76-77
致谢  77-78
个人简况及联系方式  78-80

Rhodococcus sp.R04细胞色素P450单加氧酶多态性及CYP125的功能研究

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