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生物单分子定量检测新方法及电化学发光共振能量转移

作　者: 李璐
导　师: 金文睿
学　校: 山东大学
专　业: 分析化学
关键词: 单分子检测 全内反射荧光显微术 量子点 电化学发光共振能量转移 DNA 蛋白质
分类号: O657.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文分为生物单分子定量检测新方法及电化学发光共振能量转移两部分,其中第一章至第六章为第一部分,第七章至第九章为第二部分。第一章主要对生物单分子激光诱导荧光检测涉及的各种检测方法及荧光探针进行了简要综述。在生物单分子激光诱导荧光检测中涉及的方法主要有共聚焦荧光显微术、全内反射荧光显微术、落射荧光显微术、双光子或多光子荧光显微术等。本章着重介绍了这些方法的原理及其在生物单分子定量研究中的应用,同时也对常用的荧光探针(包括有机荧光染料、纳米粒子、荧光蛋白及稀土离子等)的性质和应用做了简单介绍。第二章中我们建立了一种电化学吸附富集结合全内反射荧光显微术超灵敏的单分子成像定量新方法。我们选择罗丹明6G、Alexa-488标记的羊抗鼠IgG、以及罗丹明6G标记的DNA作为研究对象,利用电化学富集将这些分子吸附到镀有铟锡氧化物的光透导电玻片上,然后利用高灵敏的电子增强型电感耦合器(EMCCD)对玻片上的荧光分子进行全内反射成像。通过一个三维移动控制器移动玻片实现对玻片的顺次成像,对每一个样品获取100帧图片,并对其上对应单分子的荧光点计数。电化学富集的方法提高了已报道的单分子检测方法的灵敏度,结果显示浓度范围在5×10-15到5×10-12 mol/L的罗丹明6G,3×10-15到2×10-12 mol/L的Alexa-488标记的羊抗鼠IgG和3×10-15到2×10-12 mol/L罗丹明6G标记的DNA荧光点数和物质的浓度都具有良好的线性关系。第三章中我们建立了一种超灵敏的检测1.8 nL样品中蛋白质的单分子计数微阵列分析方法。有关微阵列芯片的单分子检测仅有少量文献报道,且这些工作都未能实现整个阵列点的成像。由于单分子检测是以检测到的单分子数作为定量基础,所以提高单分子计数微阵列分析法灵敏度的关键是将整个阵列点上的单分子完全成像。我们首先设计并研究出了微阵列单分子成像系统以实现整个阵列点的单分子成像,其次以量子点取代传统的有机荧光探针对生物分子进行标记,并针对量子点荧光闪烁问题提出了一种捕获微阵列上全部量子点图像的方法。再通过乙醇胺与牛血清白蛋白共同封闭基底降低背景使单分子计数微阵列分析法测定蛋白质的灵敏度比文献报道的方法提高100倍,达到1.8×10-21 mol(1080个分子)。该方法检测样品所需体积极小(1.8 nL),因此可以用来实现珍贵或者少量样品的多次取样测定。我们利用此方法测定了不同时间下人蜕膜基质细胞培养液中骨桥蛋白的含量,研究了活细胞中骨桥蛋白的表达动力学。第四章中我们利用单分子计数微阵列分析法实现了单细胞内无PCR扩增的多种基因表达的定量测定。首先用将不同的DNA1 s点样至玻片上形成形成10个亚阵列,每个亚阵列包括9个点,每个阵列点的直径约为300μm。3μL由单细胞中的mRNA反转录的cDNAs溶液滴至玻片上的亚阵列,不同的cDNAs通过杂交反应结合至亚阵列的各个点上。然后,通过与QDs标记的检测DNA2(QDs-DNA2)杂交反应,cDNAs被QDs标记。最后,使用我们在第三章中应用的单分子阵列成像设备对微阵列成像,对应单个cDNA的亮点被计数定量。这一方法可以检测至3μL样品体积中2×10-16 mol/L的DNA(360个分子),利用微阵列,10个细胞中9种基因表达可以被平行定量。实验的结果依赖于亮点的个数而不是荧光强度,减少了测定误差,保证了结果的可靠性。此方法实现了无PCR扩增的单细胞中多个基因表达的同时定量测定。第五章中我们利用亚微米粒径的磁珠作为标记物发展了一种新的简单易推广的可视单分子检测方法。以往单分子光学检测通常采用激光诱导荧光方法,常常需要高灵敏度的昂贵检测仪器,且荧光检测会受到荧光背景干扰和荧光标记物淬灭等影响。我们用粒径为300 nm的磁珠对DNA单分子标记,这些磁珠在普通光学显微镜下可以观察到。此可视单分子检测方法可以检测3μL样品中浓度低至4.0×10-16mol/L的DNA(720个分子),并实现了单细胞内多种基因的同时测定。这种直接可视的单分子检测方法有很多优点,首先普通光学显微镜即可对单分子信号成像,无需特殊的高灵敏仪器设备；其次由于单分子信号为磁珠的普通光学图像,背景不会干扰检测结果,且信号不会淬灭,因此保证了定量检测结果的可靠性。第六章中我们利用链酶亲和素修饰的磁珠结合AMCA,FAM及Cy5三种荧光染料标记的DNA,制备各种颜色的编码微珠。单个微珠上可以结合上千个染料分子,根据结合三种染料的比例不同,可以实现多种颜色微珠的制备。我们利用制备的各种微珠实现不同生物分子的单分子编码检测。第七章中我们对荧光共振能量转移(FRET)的原理及其在生物分析方面应用作了介绍。共振能量转移作为一种有力的生物分析工具在生物分子构型测定、免疫分析、核酸检测等方面广泛应用。半导体量子点(quantum dots, QD s)由于其优良的光学性能而被广泛应用于FRET体系中,将量子点作为能量供体或者受体引入生物发光共振能量转移(BRET)体系和化学发光共振能量转移(CRET)体系同样引起了人们的兴趣,本章也对QD在共振能量转移体系中的应用进行了综述。第八章中我们建立了一种新的共振能量转移模式—电化学发光共振能量转移(ECRET).以往报道的共振能量转移根据供体激发方式的不同分为荧光共振能量转移、生物发光共振能量转移、化学发光共振能量转移。以电化学发光作为光源激发供体只有能量被受体淬灭的研究,而受体得到能量发射荧光的现象未见报道。我们以鲁米诺作为能量供体,量子点作为能量受体实现了ECRET。本章对基于该体系的ECRET进行了理论计算,而且将ECRET应用至测定蛋白质之间相互作用和蛋白质构型的变化。第九章中我们研究了量子点作为能量供体,Cy5作为能量受体的电化学发光共振能量转移体系。对基于该体系的ECRET进行了理论计算,并将ECRET应用至测定蛋白质构型的变化。基于QDs-Cy5体系的ECRET不仅可以进行DNA的定性定量研究,也是蛋白质相互作用、蛋白质构型测定研究中一个有用的工具,它将为生命科学提供一种新的研究方法。

全文目录


中文摘要  16-19
ABSTRACT  19-23
符号说明  23-24
第一部分 生物单分子定量检测新方法  24-142
  第一章 生物单分子光学检测  24-48
    1.1 单分子检测  26-27
    1.2 LIFM单分子检测  27-38
      1.2.1 共聚焦荧光显微术  27-29
      1.2.2 全内反射荧光显微术  29-34
      1.2.3 落射荧光显微术  34-37
      1.2.4 其它光学方法  37-38
    1.3 荧光标记物  38-41
      1.3.1 有机荧光染料探针  38-39
      1.3.2 纳米粒子探针  39-40
      1.3.3 其它荧光探针  40-41
    1.4 前景与展望  41-42
    1.5 文献  42-48
  第二章 电化学吸附富集结合全内反射荧光显微术定量检测溶液中单分子  48-72
    2.1 引言  48-49
    2.2 实验部分  49-52
      2.2.1 材料与试剂  49-50
      2.2.2 仪器设备  50-52
      2.2.3 荧光分子电化学吸附富集至ITO导电玻片  52
      2.2.4 全内反射单分子成像  52
    2.3 结果和讨论  52-65
      2.3.1 R6G在ITO玻片上的电化学吸附富集  52-55
      2.3.2 利用全内反射荧光显微术对ITO玻片上富集的分子进行单分子成像  55-57
      2.3.3 Alexa-488标记的IgG(H+L)和R6G标记的DNA电化学吸附富集  57-61
      2.3.4 单分子计数定量检测  61-65
    2.4 结论  65
    2.5 参考文献  65-72
  第三章 纳升样品单分子计数蛋白微阵列分析及其在检测活细胞蛋白质动力学表达中的应用  72-92
    3.1 引言  72-73
    3.2 实验部分  73-78
      3.2.1 材料与试剂  73-74
      3.2.2 实验仪器  74-75
      3.2.3 玻璃片的硅烷化  75
      3.2.4 玻璃片包被抗体  75
      3.2.5 封闭  75
      3.2.6 芯片阵列的点样与标记  75-77
      3.2.7 全内反射系统进行单分子芯片微阵列成像  77
      3.2.8 DSC细胞的提取  77-78
      3.2.9 细胞上清液的提取  78
      3.2.10 基于ELISA的人OPN蛋白酶联免疫检测  78
    3.3 结果与讨论  78-88
      3.3.1 图像的获取  78-82
      3.3.2 非特异性吸附  82-83
      3.3.3 测定CEA抗原的线性范围、检测限  83-85
      3.3.4 蜕膜基质细胞中OPN蛋白表达动力学研究  85-88
    3.4 小结  88-89
    3.5 文献  89-92
  第四章 单分子计数微阵列分析测定单细胞内多基因表达  92-112
    4.1 引言  92-95
    4.2 实验部分  95-101
      4.2.1 材料与试剂  95-97
      4.2.2 实验仪器  97
      4.2.3 玻璃片包被DNA1  97
      4.2.4 制备量子点修饰的检测DNA2  97
      4.2.5 封闭  97-98
      4.2.6 tDNA的结合  98
      4.2.7 芯片阵列的标记  98
      4.2.8 细胞的培养和提取  98
      4.2.9 实时定量PCR检测细胞中基因表达  98-99
      4.2.10 利用SMCMA定量单个细胞中多种基因表达  99-101
    4.3 结果和讨论  101-107
      4.3.1 芯片制作  101-102
      4.3.2 测定合成的DNA  102-104
      4.3.3 直接定量单细胞中单个基因表达  104-107
    4.4 结论  107
    4.5 文献  107-108
    4.6 附录  108-112
  第五章 普通显微镜可见单分子检测方法及其在定量单细胞多基因表达中的应用  112-130
    5.1 前言  112-115
    5.2 实验部分  115-116
      5.2.1 材料与试剂  115
      5.2.2 实验仪器  115
      5.2.3 玻璃片硅烷化、封闭、cDNA的点样、细胞的培养、单分子荧光成像及获取单细胞cDNA  115
      5.2.4 制备MBs修饰的DNA1  115-116
      5.2.5 MBs单分子标记  116
      5.2.6 普通光学显微扫描成像  116
    5.3 结果与讨论  116-126
      5.3.1 MBs的明场成像  116-119
      5.3.2 MBs的定量  119-120
      5.3.3 MBs单分子标记  120-121
      5.3.4 背景噪音的消除  121-122
      5.3.5 利用MBs标记cDNA单分子定量单细胞内多基因表达  122-126
    5.4 结论  126
    5.5 文献  126-130
  第六章 多色微珠制备及编码单分子检测研究  130-142
    6.1 前言  130-131
    6.2 实验部分  131-135
      6.2.1 材料与试剂  131-132
      6.2.2 实验仪器  132-133
      6.2.3 制备MBs修饰的DNA2  133
      6.2.4 制备各色微球  133
      6.2.5 玻璃片的硅烷化  133
      6.2.6 DNA1的结合及基底封闭  133-134
      6.2.7 tDNA的结合  134
      6.2.8 MBs-DNA2单分子标记  134
      6.2.9 荧光编码  134
      6.2.10 荧光成像  134-135
    6.3 结果与讨论  135-140
      6.3.1 染料及滤色片的选择  135-137
      6.3.2 颜色混合及多色微球制备  137-139
      6.3.3 生物单分子检测  139-140
    6.4 结论  140
    6.5 文献  140-142
第二部分 电化学发光共振能量转移  142-198
  第七章 共振能量转移  144-158
    7.1 荧光共振能量转移  144-147
    7.2 QD在共振能量转移中应用  147-151
    7.3 前景与展望  151-152
    7.4 文献  152-158
  第八章 鲁米诺作供体量子点作受体的电化学发光共振能量转移理论及生物应用  158-182
    8.1 引言  158-161
    8.2 实验部分  161-166
      8.2.1 材料和试剂  161-162
      8.2.2 仪器设备  162-163
      8.2.3 电极的制作和表征  163-164
      8.2.4 蛋白质溶液去磷酸盐  164
      8.2.5 人IgG-ABEI及CEA-ABEI结合物的制备  164
      8.2.6 免疫反应  164-165
      8.2.7 Fn-QD结合物的制备  165
      8.2.8 ABEI-Fn-QD结合物的制备  165
      8.2.9 蛋白质的变性  165
      8.2.10 电化学发光共振能量转移光谱的检测  165-166
    8.3 结果与讨论  166-177
      8.3.1 鲁米诺荧光量子产率Φ_(Lum)  166
      8.3.2 Forster半径R_0,共振能量转移效率η_E及供受体之间的距离r_n  166-167
      8.3.3 ECRET测定DNA理论计算  167-173
      8.3.4 测定蛋白质之间的相互作用  173-175
      8.3.5 研究蛋白质构型的变化  175-177
    8.4 结论  177-178
    8.5 文献  178-182
  第九章 量子点作供体Cy5作受体的电化学发光共振能量转移研究蛋白质构型的变化  182-198
    9.1 引言  182
    9.2 实验部分  182-185
      9.2.1 实验仪器、电极的制作和表征及蛋白质溶液去磷酸盐  182
      9.2.2 材料与试剂  182-183
      9.2.3 油溶性量子点羧基化  183-184
      9.2.4 QD-Fn-DNA1-DNA2-Cy5复合物的制备及蛋白质的变性  184-185
      9.2.5 ECL检测  185
      9.2.6 ECRET光谱检测  185
    9.3 结果与讨论  185-196
      9.3.1 CdSe/ZnS QDs ECL机理  185-187
      9.3.2 QDs-Fn-Cy5 ECRET体系的建立  187-191
      9.3.3 QDs与Fn比例选择  191-192
      9.3.4 电位对QDs-Fn-Cy5体系ECRET影响  192-193
      9.3.5 研究蛋白质构型的变化  193-195
      9.3.6 Forster半径R_0,共振能量转移效率η_E及供受体之间的距离r_n  195-196
    9.4 结论  196-197
    9.5 文献  197-198
致谢  198-200
博士期间发表论文  200-201
学位论文评阅及答辩情况表  201-202
英文论文  202-248
  References  214-248

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法（物理及物理化学分析法） > 光化学分析法（光谱分析法）
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