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hOGG1基因特异性锤头状核酶体外切割活性及其在A549细胞内瞬时效应的研究

作　者: 张勤
导　师: 张遵真；张浩
学　校: 四川大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: hOGG1 锤头状核酶 DNA氧化损伤 DNA修复 肺癌
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 61次
引　用: 1次
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内容摘要


目的采用分子生物学技术与核酶技术抑制人肺腺癌A549细胞中DNA氧化损伤修复基因人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(Human8-oxoguanineDNAglycosylasel,hOGGl)的表达,以探讨肺癌的发生与发展同DNA氧化损伤修复基因的关系。 方法运用计算机软件人工设计并合成锤头状核酶基因(Ribozyme,RZ),将该核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,重组子由BamHⅠ和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。多聚酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)扩增锤头状核酶作用的靶基因hOGGl保守序列,将PCR扩增序列插入体外转录载体pBluescriptSK(+),经SPeⅠ和SacⅡ酶切电泳及测序鉴定。采用地高辛(Digoxigenin,DIG)标记检测系统,体外转录核酶基因及hOGGl基因,获得核酶与带有DIG标记的底物hOGGlmRNA。通过调整核酶体外实验中不同的反应条件,确定核酶体外切割实验方案;然后经RNA变性凝胶电泳分离切割片段,真空转印正电荷尼龙膜固定mRNA,再经DIG的检测系统反映核酶对靶基因的体外切割效率。含有核酶基因的重组载体pcDNA3.1(+)-RZ在类似脂质体的转染试剂FuGENE6的介导下引入人肺腺癌A549细胞,逆转录多聚酶链反应(ReverseTranscriptase-PCR,RT-PCR)扩增耐受新霉素的Neo基因以鉴定阳性转染细胞。以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Humanglyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,hGAPDH)为内参照,RT-PCR法半定量检测转染细胞中hOGGlmRNA的表达量。以阿霉素为受试物,MTT法检测转染前后细胞存活率的变化,彗星试验检测转染

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-13
正文  13-78
  第一部分: hOGG1特异性锤头状核酶及其靶基因的真核表达载体的构建和鉴定  13-36
    前言  13-14
    材料和仪器  14-16
    实验方法  16-26
    实验结果  26-32
    讨论  32-35
    小结  35-36
  第二部分: hOGG1特异性锤头状核酶体外切割效应研究  36-58
    前言  36-37
    材料和仪器  37-38
    实验方法  38-48
    实验结果  48-54
    讨论  54-57
    小结  57-58
  第三部分: 核酶对细胞内hOGG1基因的抑制效应研究  58-78
    前言  58-59
    材料和仪器  59-61
    实验方法  61-68
    实验结果  68-75
    讨论  75-77
    小结  77-78
结论  78-79
参考文献  79-84
附录  84-96
  综述  84-92
    影响锤头状核酶催化活性的主要因素  84-92
  中英文词汇对照表  92-94
  在读期间科研成果简介  94-95
  致谢  95-96

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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