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针对G蛋白偶联受体的SPA药物筛选技术研究

作　者: 陈仁海
导　师: 裴钢
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: GPCR 趋化因子受体 SPA-WGA 法[35S]GTPγS 结合实验 SPA-WGA 法配体受体结合实验 SPA-抗体-[35S]GTPγS 结合实验
分类号: R965.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


趋化因子受体属于G 蛋白偶联受体(G Protein-Coupling Receptor,GPCR)家族,是一类引人注目的药物靶点,本文通过免疫磁珠快速分选法(MACS)筛选得到受体在细胞表面稳定高表达并且能活化G 蛋白的CHO 细胞,最终建立了CHO-CXCR2、CHO-CXCR3、CHO-CCR3 和CHO-CCR4 细胞系。SPA(scintillation proximity assay)技术广泛用于研究分子之间相互作用,本文利用SPA 技术,建立了快速灵敏、操作简单、可高通量的针对GPCR 的药物筛选模型。主要内容如下:通过SPA 微球的最小化和细胞膜用量、孵育时间等实验条件的优化,建立了SPA-WGA 法[35S]GTPγS 结合实验和SPA-WGA 法配体受体结合实验;由于SPA-WGA 法[35S]GTPγS 结合实验只能检测与Gi/o蛋白偶联的GPCR,而SPA-WGA 法配体受体结合实验无法区别激动剂、拮抗剂和反向激动剂,为了弥补上述方法的局限,建立了SPA-抗体-[35S]GTPγS 结合实验方法。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-8
缩略符号  8-9
引言  9-22
一、 建立稳定表达GPCR 的细胞系  22-32
  1 前言  22-24
  2 实验材料  24-25
    2.1 实验试剂  24-25
    2.2 实验仪器  25
  3 实验方法  25-28
    3.1 构建CXCR2 和CXCR3 质粒  25
    3.2 质粒转染和受体表达  25-26
    3.3 流式细胞计数(FACS)检测细胞表面受体表达  26-27
    3.4 免疫磁珠快速分选法(MACS)筛选表达受体的细胞  27-28
    3.5 数据处理  28
  4 实验结果  28-30
    4.1 FACS 检测趋化因子受体在CHO 细胞表面的表达情况  28
    4.2 [355]GTPγS 结合实验检测趋化因子受体的功能  28-30
  5 讨论  30-32
二、SPA-WGA 法[(35)~S]GTPγS 结合实验(SPA-WGA-based [(35)~S]GTPγs binding assay)  32-42
  1 前言  32-33
  2 实验材料  33-34
    2.1 实验试剂  33-34
    2.2 实验仪器  34
  3 实验方法  34-35
    3.1 细胞和细胞培养  34
    3.2 细胞膜的制备  34
    3.3 SPA-WGA 法[(35)~S]GTPγS 结合实验  34
    3.4 抽滤法[(35)~S]GTPγS 结合实验  34-35
    3.5 数据处理  35
  4 实验结果  35-41
    4.1 SPA-WGA 微球用量的最小化  35-36
    4.2 CHO-CCR5 细胞膜用量的优化  36-38
    4.3 GDP 浓度的优化  38
    4.4 孵育时间的优化  38-39
    4.5 仪器测量时间范围的限定  39-40
    4.6 与抽滤法[(35)~S]GTPγS 结合实验比较  40-41
  5 讨论  41-42
三、SPA-WGA 法受体配体结合实验(SPA-WGA-based ligand-receptor binding assay)  42-46
  1 前言  42
  2 实验材料  42
    2.1 实验试剂  42
    2.2 实验仪器  42
  3 实验方法  42-43
    3.1 细胞培养和受体表达  42-43
    3.2 细胞膜的制备  43
    3.3 数据处理  43
  4 实验结果  43-45
    4.1 SPA-WGA 微球用量的最小化  43-44
    4.2 细胞膜用量的优化  44-45
    4.3 DPDPE 和Naloxone 与[3~H]DPN 竞争曲线  45
  5 讨论  45-46
四.SPA-抗体-[35S]GTPγS 结合实验(Anti-G protein SPA -based [(35)~S]GTPγS binding assay)  46-53
  1 前言  46-48
  2 实验材料  48
    2.1 实验试剂  48
    2.2 实验仪器  48
  3 实验方法  48-49
    3.1 细胞培养和受体表达  48
    3.2 细胞膜的制备  48
    3.3 SPA-抗体-[355]GTPγS 结合实验测量多巴胺受体D1 和D2 与G_s 或G_o 偶联激活情况  48-49
    3.4 实验数据处理  49
  4 实验结果  49-52
  5 讨论  52-53
全文总结  53-54
参考文献  54-59
专利  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学 > 药物筛选和实验模型
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