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小麦耐盐相关基因片段的筛选与克隆

作　者: 王涛
导　师: 刘旭
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦 cDNA－AFLP 盐胁迫 早期应答基因 mRNA差异显示
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题，耕地的减少和淡水资源的不足将迫使人类开发利用大面积的盐碱地、海岸带和滩涂地带。因此，植物耐盐生化及分子生物学机理研究由于其在理论研究和应用实践方面的重要意义，引起了国内外科学家的高度重视，是当前植物分子生物学研究的热点。在模式植物酵母、拟南芥和水稻中关于耐盐性的研究已经取得了很大的进展，然而对农作物小麦的耐盐机理还知之甚少。为了研究这一问题，我们利用RNA指纹技术cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymophism)分析了耐盐性较强的小麦材料98-160在盐胁迫和非胁迫下基因表达的差异。采用74对引物组合，分离到了26个有差异的cDNA片段，其中包括盐胁迫诱导表达的12个，诱导增强表达的4个和抑制表达的10个，通过Reverse Northern Blot进一步筛选出了3个阳性克隆。Northern Blot结果显示，其中2个cDNA片段(SⅠ、SⅡ)呈阳性反应，在对照叶片中表达量很少，但在盐胁迫的小麦叶片中表达量明显增加，证明这2个片段与盐胁迫有关，表达受盐胁迫诱导。为了进一步弄清SⅠ、SⅡ的结构，我们对它们进行了克隆和测序分析，SⅠ大小307bp，SⅡ大小200bp，GenBank查询结果显示SⅠ与一系列激酶有较高的同源性(50％～70％)，很可能是一个与抗渗透胁迫有关的基因片段。SⅡ与已知基因同源性较低，可能是一个新基因的一部分。

全文目录


中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
第一章 文献综述  8-23
  1 盐害对植物的影响  8-9
  2 植物对高盐环境的生理反应  9-15
    2．1 脯氨酸  9-10
    2．2 甘氨酸甜菜碱  10-11
    2．3 调渗蛋白  11-12
    2．4 渗透胁迫信号的识别及传导  12-14
    2．5 脱落酸（ABA）  14
    2．6 盐胁迫下诱导合成的酶  14-15
  3 植物耐盐相关基因的分子克隆、表达调控及染色体定位研究  15-20
    3．1 植物耐盐相关基因的分子克隆与表达调控  15-18
    3．2 耐盐相关基因的染色体定位  18-19
    3．3 用mRNA差异显示方法分析植物盐胁迫应答基因及其表达特性  19-20
  4 耐盐转基因技术研究与转基因植物的筛选  20-23
第二章 小麦植株耐盐相关基因的筛选与克隆  23-47
  1 材料与方法  24-37
    1．1 材料  24
    1．2 方法cDNA-AFLP  24-37
      1．2．1 总RNA的提取和cDNA的制备  25-27
        1．2．1．1 总RNA的提取  25
        1．2．1．2 双链cDNA的合成  25-27
      1．2．2 AFLP  27-29
        1．2．2．1 模板cDNA浓度的检测  27
        1．2．2．2 酶切及与接头连接  27
        1．2．2．3 预扩  27-28
        1．2．2．4 选扩  28
        1．2．2．5 胶的制备  28-29
        1．2．2．6 电泳  29
        1．2．2．7 银染程序  29
      1．2．3 聚丙烯酰胺凝胶中差异片段的回收  29-30
      1．2．4 二次PCR扩增  30
      1．2．5 PCR产物纯化  30-31
      1．2．6 反向Northern杂交  31-32
        1．2．6．1 点膜  31
        1．2．6．2 预杂交  31
        1．2．6．3 cDNA探针标记  31-32
        1．2．6．4 探针变性  32
        1．2．6．5 杂交  32
        1．2．6．6 洗膜  32
        1．2．6．7 放射自显影  32
      1．2．7 Northern杂交  32-34
        1．2．7．1 小麦总RNA的提取  32-33
        1．2．7．2 转膜  33
        1．2．7．3 Northern杂交  33-34
      1．2．8 特异片段的连接、转化  34-36
      1．2．9 阳性克隆鉴定  36
      1．2．10 序列测定  36-37
  2 结果与分析  37-44
    2．1 总RNA的检测结果  37
    2．2 双链cDNA的合成  37-38
    2．3 cDNA-AFLP  38-40
    2．4 差异带的回收  40-41
    2．5 二次PCR扩增  41
    2．6 反向Northern杂交  41-42
    2．7 差异片段克隆  42
    2．8 差异片段的序列分析与比较  42-43
    2．9 Northern杂交  43-44
  3 讨论  44-46
  4 结论  46-47
参考文献  47-56
附录  56-60
致谢  60

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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