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干细胞因子和胰岛素对小鼠小肠Cajal间质细胞的作用

作 者: 张蔚
导 师: 林琳
学 校: 南京医科大学
专 业: 外科学
关键词: 胰岛素 干细胞因子 Cajal间质细胞 平滑肌细胞
分类号: R587.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 28次
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内容摘要


Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)是胃肠动力的起搏细胞,且具备介导神经递质传递的作用和机械感受器功能,多种胃肠功能障碍与ICC数量的减少和功能异常有关。干细胞因子(stem cell factor,SCF)是ICC特异性标志物c-Kit(酪氨酸激酶受体)的天然配基,SCF/Kit信号对ICC的表型维持、增殖分化等有重要作用,平滑肌细胞(SMC)能够分泌有活性的SCF,进而调控ICC的生长。一定浓度的胰岛素(Insulin)或IGF-1可以阻止/逆转DM相关的胃肠ICC病变,对破坏的SMC亦有恢复作用,研究发现ICC表面不表达Ins受体,而SMC表面表达Ins受体。本研究探讨体外SCF和Ins干预对肠道ICC生长的影响及可能的机制,【目的】探讨DM相关的胃肠ICC病变时,其上游调控因子Ins和SCF作用于ICC的途径。【方法】1、小鼠小肠ICC分离、培养及鉴定:新生ICR小鼠断头处死,无菌条件下取小肠组织,应用酶解法分离小肠ICC;用含10%胎牛血清和5ng/ml SCF的M199培养液进行原代培养,ICC稳定培养三天,作c-kit免疫荧光染色鉴定。2、流式细胞仪检测ICC和SMC含量: ICC稳定培养三天,EDTA消化成细胞悬液,分别予c-kit抗体标记ICC,α-actin抗体标记SMC,流式细胞仪检测ICC和SMC含量。3、外源性SCF干预: ICC分为对照组和SCF干预组,对照组培养液中不加SCF,SCF干预组培养液中添加SCF 5ng/ml,培养72小时,c-kit免疫荧光染色观察ICC形态和数量,荧光定量RT-PCR检测c-kit mRNA表达情况。4、外源性Ins干预:分为四组:ICC稳定培养24小时,添加牛Ins:0、10、30、50ug/ml,培养48小时,荧光定量RT-PCR检测c-kit和SCF mRNA表达,c-kit免疫荧光染色观察ICC形态及数量,c-kit与ki-67双重免疫荧光染色检测ICC增殖状况。【结果】1、ICC培养与鉴定:细胞培养24小时后,可见ICC贴壁,呈三角形或梭形,有少量突起,核大,核周有少量胞浆,培养48-72小时后可见ICC突起变长,与邻近ICC相互连接成网络状。ICC周围可见长梭形,折光度高,核较小,胞浆丰富的SMC,呈团块状聚集生长。c-kit免疫荧光染色显示:ICC表面c-kit阳性,胞体和突起均明显着色,细胞连接成网状。2、流式细胞检测ICC和SMC含量:培养细胞中ICC阳性率为15.67±3.11%,SMC阳性率为64.2±7.35%。3、外源性SCF干预:与对照组比较,加入SCF后,ICC数量增多,细胞间更多连接成网络,有明显差异性(P<0.05),而c-kit mRNA表达两组无明显差异(P>0.05)。4、外源性Ins干预:与对照组相比,添加不同剂量的Ins后,c-kit mRNA及SCF mRNA表达增加(P<0.05),均呈剂量依赖性;Ins组ICC数量增加(P<0.05),ICC表面c-kit受体表达增强,但ICC增殖无明显改变(P>0.05)。【结论】1、外源性SCF干预有助于维持ICC表型,促进体外ICC生长,但外源性SCF干预后,ICC表达c-kit mRNA无明显增加,可能原因:实验误差(本实验细胞培养困难,仅能原代培养,细胞量较少,因而干预浓度和时间点设组较少);存在外源性SCF负反馈性下调c-kit mRNA的可能,部分抵消了SCF的促ICC生长作用,可进一步行单细胞RT-PCR检测单个ICC c-kit mRNA是否变化。2、在ICC与SMC共培养体系内,外源性Ins可促进ICC生长,促进ICC表达c-kit mRNA,以及ICC表面c-kit受体表达;外源性Ins亦上调SCF mRNA表达,因而外源性Ins可能诱导SMC产生内源性SCF增多,维持ICC生长。3、在ICC与SMC共培养体系内,外源性Ins没有使ICC增殖明显增加,是否实验误差(ICC培养困难,无法传代,实验重复次数不够多)、还是Ins和SCF可能是通过其他的途径维持ICC的生长(如减少ICC凋亡,避免ICC表型转变等),有待研究。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-14
第一部分:小鼠小肠 Cajal 间质细胞的分离培养和鉴定  14-23
  材料和方法  14-18
  结果  18-21
  讨论  21-22
  参考文献  22-23
第二部分:外源性SCF 干预对小鼠小肠ICC 的影响  23-32
  材料和方法  23-26
  结果  26-29
  讨论  29-30
  参考文献  30-32
第三部分:外源性Ins 干预对小鼠小肠 ICC 及SCF 的影响  32-45
  材料和方法  32-35
  结果  35-42
  讨论  42-43
  参考文献  43-45
小结  45-46
综述  46-55
  参考文献  51-55
个人小结  55-56
附录  56-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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