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基因传感器检测木质素降解酶基因及堆肥群落多样性研究

作　者: 李贞
导　师: 曾光明
学　校: 湖南大学
专　业: 环境工程
关键词: 基因传感器 木质素降解 锰过氧化物酶 纤维二糖脱氢酶 群落多样性
分类号: S141.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


堆肥化技术在城市生活垃圾处理中已经得到越来越广泛地应用。堆肥系统中,微生物降解木质素的代谢过程由一系列酶共同完成,而锰过氧化物酶（MnP）和纤维二糖脱氢酶（CDH）在其中起了关键性作用。用DNA生物传感器检测其编码基因,能更好地了解这两种酶的协同作用。本研究拟制备固定化核酸探针传感器用于检测黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶的编码基因,探讨DNA传感器用于同时检测两种堆肥高效降解菌产酶基因的可行性。同时运用PCR-DGGE技术对堆肥中微生物群落多样性进行了研究。首先研究了DNA生物传感器单独检测黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶编码基因。利用自组装单分子膜技术,将巯基修饰的探针固定在金电极表面。采用交流阻抗法和循环伏安法,表征疏基修饰的ssDNA在金电极上的固定及杂交过程。再用计时电流法扫描,得出电化学信号与目标链浓度间的线性关系。研究了目标序列的线性检测范围、特异性以及各种影响因素。该传感器的线性范围为4×10-7～1×10-12 M,检测限为1.0×10-12 M。接着,将巯基修饰的两种木质素降解酶—锰过氧化物酶、纤维二糖脱氢酶的寡核苷酸探针通过自组装的方法固定在金电极表面。通过靶基因序列与其互补链之间夹心式杂交后序列的高度选择性和极强的分子识别能力,将辣根过氧化物酶、漆酶分别标记在不同的酶基因上,利用酶标的不同催化反应将杂交信号放大,实现对两种木质素降解酶编码基因同时进行电化学检测。锰过氧化物酶、纤维二糖脱氢酶靶基因序列的浓度分别在1.0×10-11～4.0×10-8 M和1.0×10-10～4.0×10-8 M范围时,其浓度的对数值和两种酶催化反应产生的电流变化值呈线性相关关系,相关系数分别为0.9884和0.9881,检出限分别为1.0×10-11 M和5.0×10-11 M。同一目标链浓度均平行测定三次,其RSD分别为4.30%和3.52%。该传感器特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性也较好。最后,通过PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）方法分析了堆肥过程中微生物群落结构多样性及其变化规律。测定了堆肥过程中pH、温度、有机质含量、C/N的变化,4个指标均反映出这是一个典型的堆肥过程。PCR-DGGE图谱显示:不同时间堆肥样的DGGE图谱有着明显的差异性,温度对堆肥过程中微生物种群具有明显的筛选作用。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-12
插图索引  12-14
附表索引  14-15
第1章 绪论  15-38
  1.1 木质素降解微生物及酶系  16-25
    1.1.1 堆肥中木质素降解微生物的种类  16-17
    1.1.2 木质素降解酶系  17-21
    1.1.3 木质素生物降解机理  21-24
    1.1.4 影响木质素降解的主要因素  24-25
  1.2 常规方法检测木质素降解酶基因  25-26
    1.2.1 普通分子生物学方法检测木质素降解酶编码基因  25-26
    1.2.2 酶生物传感器检测木质素降解酶  26
  1.3 DNA 生物传感器的工作原理、分类及应用  26-34
    1.3.1 DNA 生物传感器的工作原理  26-27
    1.3.2 DNA 生物传感器的分类  27-30
    1.3.3 DNA 探针的固定方法  30-31
    1.3.4 DNA 生物传感器的应用  31-34
  1.4 DNA 生物传感器的优缺点及发展趋势  34-37
    1.4.1 DNA 生物传感器的优缺点  34-35
    1.4.2 DNA 生物传感器的发展趋势  35-37
  1.5 展望  37-38
第2章 PCR-DGGE 技术应用于堆肥中微生物群落结构分析的可行性探讨  38-46
  2.1 堆肥中的微生物学过程  38-39
    2.1.1 真菌  38-39
    2.1.2 放线菌和细菌  39
    2.1.3 病原微生物  39
  2.2 DGGE 技术的原理  39-40
  2.3 PCR-DGGE 技术在环境工程生物处理研究中的应用  40-41
    2.3.1 在废水生物处理研究中的应用  40-41
    2.3.2 在废气生物处理研究中的应用  41
    2.3.3 在污泥生物处理研究中的应用  41
  2.4 PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的应用  41-42
    2.4.1 分析微生物多样性  41-42
    2.4.2 监测微生物群落动态性  42
  2.5 PCR-DGGE 技术的优势、局限性及应用前景  42-44
    2.5.1 PCR-DGGE 技术的优势  42-43
    2.5.2 PCR-DGGE 技术的局限性  43
    2.5.3 PCR-DGGE 技术的应用前景  43-44
  2.6 PCR-DGGE 用于堆肥中群落结构分析的可行性  44-46
第3章 木质素降解酶基因序列分析及探针设计  46-50
  3.1 木质素降解酶编码基因序列分析  46-47
  3.2 木质素降解酶编码基因探针设计  47-50
    3.2.1 影响 Primer Premier 5.0 软件设计的因素  47
    3.2.2 探针及引物设计的原则  47-49
    3.2.3 两种酶编码基因探针及引物  49-50
第4章 DNA 生物传感器单独检测MnP 编码基因  50-62
  4.1 引言  50-51
  4.2 实验部分  51-54
    4.2.1 仪器与试剂  51
    4.2.2 实验方法  51-53
    4.2.3 磷酸盐缓冲液pH 值的优化  53
    4.2.4 杂交时间的优化  53-54
    4.2.5 杂交温度的优化  54
    4.2.6 对苯二酚浓度的优化  54
    4.2.7 过氧化氢量的优化  54
    4.2.8 传感器的再生及特异性  54
  4.3 结果与讨论  54-60
    4.3.1 磷酸盐缓冲液pH 值的优化  54-55
    4.3.2 杂交时间的优化  55
    4.3.3 杂交温度的优化  55-56
    4.3.4 对苯二酚浓度的优化  56-57
    4.3.5 过氧化氢量的优化  57-58
    4.3.6 裸金电极、ssDNA/Au 电极及dsDNA/Au 电极的电化学表征  58-59
    4.3.7 MnP 编码基因的线性检测范围  59
    4.3.8 传感器的再生及特异性  59-60
  4.4 结论  60-62
第5章 DNA 生物传感器同时检测MnP 与CDH 编码基因  62-73
  5.1 引言  62
  5.2 实验部分  62-66
    5.2.1 仪器与试剂  62-63
    5.2.2 实验方法  63-64
    5.2.3 磷酸盐缓冲液pH 值的优化  64-65
    5.2.4 探针固定时间的优化  65
    5.2.5 杂交时间的优化  65
    5.2.6 杂交温度的优化  65
    5.2.7 传感器的重复性及特异性  65-66
    5.2.8 传感器的稳定性及抗干扰性  66
  5.3 结果与讨论  66-72
    5.3.1 磷酸盐缓冲液pH 值的优化  66
    5.3.2 探针固定时间的优化  66-67
    5.3.3 杂交时间的优化  67
    5.3.4 杂交温度的优化  67-68
    5.3.5 同时检测MnP 和CDH 编码基因  68-69
    5.3.6 传感器的重复性及特异性  69-71
    5.3.7 传感器的稳定性及抗干扰性  71-72
  5.4 结论  72-73
第6章 PCR-DGGE 分析堆肥中群落结构多样性  73-82
  6.1 引言  73-74
  6.2 实验部分  74-76
    6.2.1 实验材料  74
    6.2.2 实验仪器  74
    6.2.3 实验试剂  74
    6.2.4 基因组总DNA 的提取与纯化  74-75
    6.2.5 PCR-DGGE 分析  75-76
  6.3 结果与讨论  76-80
    6.3.1 堆肥过程中温度、pH、有机质含量、C/N 的变化  76
    6.3.2 堆肥样基因组总DNA 的提取与纯化  76-78
    6.3.3 堆肥样品PCR-DGGE 群落多样性分析  78-80
  6.4 结论  80-82
结论  82-84
参考文献  84-95
附录 A 攻读学位期间发表的论文及申请的专利  95-96
致谢  96

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中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 肥料学 > 农家肥料 > 堆肥、沤肥
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