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体外存放和甲醛处理对孕妇血浆中胎儿DNA水平的影响的实验研究

作　者: 李勤
导　师: 惠宁；孙树汉
学　校: 第二军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 孕妇外周血浆胎儿游离DNA 荧光定量PCR 细胞裂解 DNA酶甲醛
分类号: R714.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

孕妇血浆中的cffDNA(cell-flee fetal DNA,cffDNA)的发现为进行无创性产前诊断提供了一条崭新的途径,目前孕妇外周血中的胎儿DNA的非创伤性产前检测已能做到明确胎儿性别、诊断性连锁疾病和Rh血型,以及某些染色体异常等疾病的诊断。cffDNA在孕6周时即可从孕妇血浆中检出,早于绒毛膜取样和羊水穿刺等传统的创伤性产前诊断胎儿样品的取样时间,因此对血浆cffDNA检测技术的研究将对无创性产前诊断技术的发展产生重大影响。但是,孕妇血浆中cffDNA的量甚微,仅占总游离DNA的很少部分,约5%-7%。大量母源DNA的存在会降低微量胎儿DNA的检出灵敏度,尤其使得那些与母亲DNA序列差异不大的胎儿DNA序列如点突变的检测变得更加困难。而前期研究已发现不同的血样处理方法能极大地影响血浆中游离DNA的量和胎儿DNA的比率,从而影响胎儿DNA的定量和定性分析。因此对于血样处理过程中有可能影响到最终cffDNA检测的因素需要进行全面深入的鉴定和分析,以建立优化和标准的临床血样处理规范,保证从血浆中获得稳定的高比例的cffDNA。国外研究已经对血样处理过程中的诸多影响因素进行了分析,如已发现分离血浆的离心力过大,可能导致血液白细胞受损释出DNA,降低胎儿DNA的比率,另外,使用不同的抗凝剂、游离DNA的抽提方法等都能影响所得游离DNA中胎儿DNA的比率。除上述因素之外,血样采集后白细胞可能在体外不断死亡和裂解,释放更多的母源DNA。另一方面,血浆中DNA酶亦有可能不断降解游离DNA,使胎儿DNA不断减少。因此血样采集后存放时间的不同亦有可能极大地影响cffDNA的比率,但目前对血样采集后白细胞在体外死亡和裂解的情况、血浆DNA酶降解游离DNA的作用及其对血浆游离DNA水平的影响尚未进行过深入研究。本实验研究分两部分:1、血样采集后体外存放对孕妇血浆中游离DNA水平的影响;2、甲醛处理对孕妇外周血中cffDNA水平的影响及其作用机理。第一部分血样采集后体外存放对孕妇血浆中游离DNA水平的影响目的:探讨孕妇血样采集后体外存放时间对血浆中游离DNA水平的影响。方法:以实时定量PCR检测孕妇外周游离DNA水平,AnnexinV/PI双染色法流式分析血样白细胞死亡情况,单相酶扩散法测定血浆DNA酶活性,速率法检测血浆乳酸脱氢酶活性。结果:4℃存放条件下,总DNA在6h内稳定:不变,24h后略有增加,36h后大量增加,而胎儿DNA在0h-24h内均恒定不变,24h时胎儿DNA略有减少,但没有统计学差异,36h时胎儿DNA明显下降(P＜0.05)。胎儿DNA占总DNA百分比的平均值从0h的15.5%(8.9-25%)和6h的15.8%(8.0-21.9%)下降到了24h的13.3%(5.6-17.8%),而36h只有4.9%(3.4-7.3%)。结论:血样存放过程中游离DNA水平的变化可能与血液白细胞裂解和血浆DNA酶的降解有关。第二部分甲醛处理对孕妇外周血中cffDNA水平的影响及其作用机理目的:探讨甲醛处理对血浆中cffDNA水平的影响及其作用机制。方法:取孕妇外周静脉血,分别给予甲醛处理和非甲醛处理,体外4℃存放不同时间后离心分离血浆,抽提游离DNA,以实时定量PCR检测总DNA和胎儿DNA水平,台盼蓝细胞染色分析血样白细胞死亡裂解情况,单相酶扩散法测定血浆DNA酶活性。结果:在血样采集后的最初6h内,血浆中总游离DNA和胎儿DNA水平保持恒定,甲醛处理对血浆中游离DNA水平无影响。但血样体外存放时间延长至36h时,血浆总游离DNA水平明显升高,而cffDNA减少;导致cffDNA百分比明显下降;甲醛处理则通过阻断白细胞裂解和抑制血浆DNA酶活性保持血浆游离DNA水平的稳定,与未处理组相比,胎儿DNA占总DNA百分比的平均值从原来的4.6%(3.8-6.8%)升高到了13.1%(10.3-17.0%)。结论:甲醛处理可以使孕妇血样体外存放36h后,胎儿DNA占总DNA百分比保持在初始取血时水平,其作用可能与抑制细胞裂解和DNA酶有关。本研究提出:为保持游离DNA水平的基本稳定,血样采集后应尽快处理,采集后4℃存放条件下,应于6h内处理,此时尚无血液白细胞死亡,而且血浆中低水平的DNA酶活性尚不能明显降解cffDNA的水平。如不能及时转运至检测中心,此时应采取低温保存,同时加入甲醛,以稳定细胞膜,阻止白细胞的裂解和DNA酶降解,可以延长血样的体外可存放时间,减缓游离DNA水平的变化。综上,本项研究对建立合理的孕妇血样处理的规范具有重要的意义。

体外存放和甲醛处理对孕妇血浆中胎儿DNA水平的影响的实验研究

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